NEUTRALIZACION CRUZADA DE VENENO DE BOTHROPS JARARACUSSU POR SUEROS ANTIOFIDICOS HETEROLOGOS

ADOLFO R. de ROODT1, JUAN C. VIDAL2, SILVANA LITWIN1, J. CHRISTIAN DOKMETJIAN1, JORGE A. DOLAB2, SILVIA E. HAJOS3, LILIANA SEGRE1

1 Instituto Nacional de Producción de Biológicos ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán, Ministerio de Salud; 2 Area lología, Museo Argentino de Ciencias Naturales Bernardino Rivadavia; 3 Cátedra de Inmunología, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires

Key words: Bothrops jararacussu, antivenoms, snake bites

Resumen

En la Argentina se utilizan tres tipos de sueros antiofídicos frente a la mordedura de crotálidos, el Anticrotálico Monovalente, contra el veneno de Crotalus durissus terrificus (“víbora de cascabel”), el Botrópico Bivalente y el Botrópico Tetravalente (“Misiones”) contra los venenos de las diferentes especies de Bothrops que se encuentran en la Argentina (las diferentes “yarará”). Además, existe un suero Botrópico-Crotálico (Trivalente) el cual cubriría el mismo espectro que el Bivalente más el Anticrotálico. En este trabajo estudiamos la reactividad inmunoquímica de los sueros antibotrópicos Bivalente y Tetravalente, del Botrópico Crotálico (Trivalente) y del Anticrotálico Monovalente con el veneno de Bothrops jararacussu (“yararacuzú”, “tapete dourado”). Además, se estudió la capacidad neutralizante de estos antivenenos sobre la potencia letal, y las actividades hemorrágica, necrotizante, procoagulante y hemolítica indirecta del veneno de B. jararacussu. La potencia neutralizante sobre las actividades biológicas y tóxicas de este veneno por todos los antivenenos utilizados es similar a la obtenida con el suero antibotrópico tetravalente (homólogo). Estos resultados sugieren la posibilidad de emplear sueros antibotrópicos heterólogos en el tratamiento de los accidentes por B. jararacussu.

Abstract

Cross neutralization of bothrops jararacussu venom by heterologous antivenoms. We have studied the immunochemical cross-reactivity and cross-neutralization of the lethal potency, hemorrhagic, necrotizing, procoagulant and (indirect) hemolytic activities of Bothrops jararacussu venom by the standard antivenoms produced in Argentina. These antivenoms are horse immunoglobulin F (ab‘)2 fragments from animals immunized with 1) Crotalus durissus terrificus venom (Monovalent Anticrotalic antivenom); 2) Bothrops alternatus and B. neuwiedii venoms (Bivalent Botropic antivenom); 3) B. alternatus, B. neuwiedii; B. jararaca and B. jararacussu venoms (Tetravalent Bothropic, or «Misiones» antivenom) and 4) B. alternatus, B. neuwiedii and C. d. terrificus venoms (Trivalent Botropic-Crotalic antivenom). In preincubation experiments, all the heterologous antivenoms neutralized the toxic and biological activities of B. jararacussu venom with a potency at least as high as the Tetravalent Botropic (i.e. the only homologous) antivenom, in which B. jararacussu venom was included as immunogen. These results suggest the possibility of using heterologous antibothropic antivenoms for the treatment of snake bites by B. jararacussu.

Dirección postal: Dr.Adolfo R. de Roodt, Instituto Nacional de Producción de Biológicos ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán, Av Vélez Sarsfield 563, 1281 Buenos Aires, Argentina Fax: (54-11)4303-2492; E-mail: aderoodt@ba.net

Recibido: 30-X-1998 Aceptado: 3-III-1999

Bothrops jararacussu («yararacuzú», «tapete doura-do»), el representante de mayor tamaño del Género Bothrops (B.) en la Argentina, tiene dos características de importancia desde el punto de vista médico. La primera es la elevada potencia letal de su veneno, una de las más altas dentro de las especies de este Género que habitan la Argentina1. La segunda es que la cantidad de veneno obtenida por extracción (~ 60 mg/100 g de peso corporal) resulta 2-4 veces mayor que la que se obtiene con otras especies de Bothrops2.
Estas dos características, junto con el gran tamaño de los especímenes adultos ( ~ 2.0 m de longitud) justifican ampliamente los nombres aborígenes de esta especie: «suru-cucú- apeté» («ssu» penetrar violentamente; «cucú», verter mucho, en el sentido de fluir y «apeté», caer cerca)3.
A la gran cantidad de veneno que puede inocular y la elevada potencia letal del mismo debe agregarse un factor de riesgo dependiente del hábitat de esta especie, que en la Argentina se encuentra limitado a la Provincia de Misiones3, 4. Los accidentes humanos por B. jarara-cussu ocurren en individuos que habitan o incursionan en zonas selváticas, habitualmente alejadas de centros asistenciales. Esto hace que el tratamiento precoz del accidente ofídico sea muchas veces imposible.
Tanto las características específicas de B. jarara-cussu, como las condicionadas por su hábitat, determinan que los accidentes ofídicos producidos por esta especie sean siempre graves.
El único tratamiento específico del accidente ofídico consiste en la administración parenteral de suero antitóxico (antiofídico) y el Instituto Nacional de Producción de Biológicos-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán (INPB) prepara un suero Antibotrópico Tetravalente («Misiones») que, entre sus inmunógenos contiene veneno entero de B. jararacussu. Este suero antitóxico se considera la terapia específica apropiada para los accidentes por B. jararacussu.
Teniendo en cuenta el importante grado de reactividad inmunológica cruzada que se observa entre los diferentes venenos botrópicos y sueros antitóxicos heterólogos contra venenos de varios crotálidos5, 10, en el presente trabajo se evaluó la reactividad inmunoquímica y la capacidad neutralizante de los distintos antivenenos producidos por el INBP frente a la potencial letal, las actividades hemorrágica, procoagulante, hemolítica indirecta y necrotizante del veneno de B. jararacussu.

Materiales y métodos

Veneno

El veneno de Bothrops jararacussu se obtuvo por extracción manual a partir de 18 especímenes adultos sanos, provenientes de la provincia de Misiones. El veneno, colectado en placas de Petri estériles fue inmediatamente desecado al vacío; fraccionado en frascos con cierre hermético y conservado a 4° C en la oscuridad. Las soluciones de veneno se prepararon inmediatamente antes de ser usadas en CINa 0.15 M y se esterilizaron por filtración.

Antivenenos

Todos los antivenenos utilizados contenían el fragmento F(ab’)2 de inmunoglobulinas equinas y fueron producidos por el Instituto Nacional de Producción de Biológicos-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán. La potencia antitóxica homóloga de cada suero se determinó por la técnica convencional (suero fijo-veneno variable) utilizada para controlar los sueros antiofídicos en Argentina6.
Suero antibotrópico Bivalente (En adelante, 2B): Producido por la inmunización con los venenos de Bothrops alternatus («yarará», «víbora de la cruz» o «urutú») y Bothrops neuwiedii («yarará chica», «cabeza candado» o «yararaca pintada»). Serie 246/93. Un mililitro de este antiveneno neutraliza 5 mg de veneno de B. alternatus y 4.8 mg de veneno de B. neuwiedii. Vencimiento 3/97.
Suero antibotrópico Tetravalente (En adelante, 4B): Producido por la inmunización con los venenos de las dos especies mencionadas más los venenos de Bothrops jararacussu («yararacussu», «tapete dourado») y Bothrops jararaca («yara-raca», «queimadora»). Serie 420/94. Un mililitro de este antiveneno neutraliza 3.8 mg de veneno de B. alternatus, 3.4 mg de veneno de B. neuwiedii, 3.1 mg de veneno de B. jararaca y 2.6 mg de B. jararacussu. Vencimiento 7/97.
Suero antibotrópico crotálico Trivalente (En adelante 3BC): Producido por la inmunización con los venenos de B. alternatus, B. neuwiedii y Crotalus durissus terrificus («víbora de cascabel»). Serie 301/96. Un mililitro de este antiveneno neutraliza 4.0 mg de veneno de B. alternatus, 3. 8 mg de B. neuwiedii y 0.6 mg de C. d. terrificus. Vencimiento 10/2001).
Suero anticrotálico: (En adelante, 1C): Producido por la inmunización con veneno de C. d. terrificus. Serie 325/96. Un mililitro de este antiveneno neutraliza 2.0 mg de veneno de C. d. terrificus. Vencimiento 10/99.

ELISA

Se emplearon policubetas de 96 pocillos (Corning) sensibilizadas con veneno (1.0 µg/ml en amortiguador de barbital sódico pH 9.0 a 4° C por 12 h) y lavadas con amortiguador de fosfato 10 mM pH 7.4 conteniendo 0.05% de Tween 20 y 10% de leche descremada como solución de bloqueo. Los volúmenes de muestras de incubación fueron en todos los casos 100 µl y luego de cada incubación se lavaron 4 veces con 300 µl de NaCI 0.15 M, amortiguador de fosfato 10.0 mM pH 7.4 conteniendo 0.05% de Tween 20. Los pocillos se incubaron (30 minutos, a 37° C) sucesivamente con diluciones (1/200 a 1/128.000) de los diferentes antivenenos y una dilución 1:10.000 de conjugado IgG anti-equino de conejo conjugado con peroxidasa (Sigma). El revelado se efectuó con o-fenilendiamina y peróxido de hidrógeno a pH 5.7 durante 25 min en la oscuridad y la reacción se detuvo con ácido sulfúrico 3.0 N. Se determinó la absorbencia a 490 nm con un lector de ELISA. Se emplearon como controles negativos pocillos sensibilizados con veneno, omitiendo la incubación con antiveneno o incubados con suero equino normal.

Dosis letal 50 (DL50.) del veneno de B. jararacussu

Ratones cepa CF-1, de 18-22 g de peso (n = 10) se inyectaron con cantidades crecientes de veneno de B. jararacussu por vía intraperitoneal y se determinó el tiempo de muerte. El cálculo de la DL50 se realizó a partir de la representación gráfica de Dosis en función de [Dosis/Tiempo de muerte]11. El análisis por regresión lineal se efectuó usando el Software Prisma (Graph Pad Software, Inc. San Diego, California, U.S.A.).

Seroneutralización de la actividad letal

Para cada dosis se utilizaron grupos de 10 ratones cepa CF-1, de 18-22 g de peso. Los ratones se inyectaron por vía intraperitoneal con 200 µg (11.6 DL50) de veneno de B. jararacussu preincubado 30 min a 37°C con NaCI 0.15 M (control positivo) o con distintas cantidades de los diferentes antivenenos. El grado de protección se estimó como DE50 (Dosis Efectiva 50), expresada como la cantidad de antiveneno que reduce el efecto letal de 11.6 DL50 de veneno al 50%, y se calculó por regresión no lineal de la curva de sobrevida en función de los µl de antiveneno utilizado.

Seroneutralización de la actividad hemorrágica

Se determinó en ratones cepa CF-1 de 25 g de peso. Cuatro grupos (6 animales cada uno) se inyectaron por vía intradérmica con 100 µg de veneno de B. jararacussu preincubado 30 min a 37 °C con NaCI 0.15 M (control positivo, @ 7.0 DMH) y con distintas cantidades de los diferentes antivenenos. El área de hemorragia se calculó por el método de Kondo modificado12, 14. Se asignó un valor de 100 a la media del área hemorrágica determinada en el grupo control positivo. Las DE50 de cada antiveneno se determinaron por regresión no lineal de la curva de área hemorrágica en función de la cantidad de antiveneno.
Seroneutralización de la actividad necrotizante

Se determinó en ratones CF-1 de 25 g de peso. Cuatro grupos (6 ratones cada uno) se inocularon por la vía intradérmica con 100 µg de veneno de B. jaracussu preincubado 30 min a 37°C con NaCI 0.15 M (control positivo, @ 3.0 DMN) o con 25, 50 o 100 µl de antiveneno en un volumen total de 150 µl. El área de necrosis se calculó según el método de Kondo14. Se asignó un valor de 100 a la media del área de necrosis del grupo control positivo. Las DE50 para cada antiveneno se determinaron por regresión no lineal de la curva de área necrótica en función de la cantidad de antiveneno.

Seroneutralización de la actividad procoagulante

Se determinó utilizando la técnica descripta por Theakston & Reid según la modificación descrita por Ferreira12, 14. Se preincubaron 50 µl de solución de veneno (1.0 mg/ml) con 50 µl de NaCI 0.15 M o con 50 µl del antiveneno durante 30 minutos a 37°C. Se adicionaron 500 µl de plasma humano normal (contenido de fibrinógeno 2.8 g/dl) y se determinaron los tiempos de coagulación de los controles positivos (veneno en NaCI) y de las muestras preincubadas con antiveneno. La inhibición de la actividad procoagulante por preincubación con el antiveneno se estimó a partir del incremento en el tiempo requerido para la formación del coágulo.

Seroneutralización de la actividad hemolítica indirecta en medio líquido

Se utilizó la técnica de Al-Abdhula15 con ciertas modificaciones. Brevemente, las muestras conteniendo 100 µg de veneno se preincubaron 30 min a 37°C con NaCI 0.15 M o con distintas cantidades de los diferentes antivenenos en un volumen final de 300 µl. Las muestras se adicionaron a 10.0 ml de una mezcla conteniendo 0.5 ml de glóbulos rojos humanos lavados; 0.5 ml de yema de huevo y 100 µl de CaCI2 0.1 M en NaCI 0.15 M, amortiguador de fosfato 10 mM pH 7.4 y se incubaron durante 180 minutos a 37°C. La reacción se detuvo con 1 ml de EDTA al 10%. Las mezclas se centrifugaron a 1500 RPM durante 30 minutos y se determinó la absorbencia a 550 nm de los sobrenadantes. Se empleó como blanco la misma mezcla incubada con 300 µl de NaCI 0.15 M, y como controles positivos la misma mezcla de reacción incubada con 100 µg de veneno en 300 µl de NaCI 0.15 M. Con todos los venenos, se calculó la media de las lecturas de absorbencia a las que se asignó un valor de 100 y las DE50 de cada antiveneno se determinaron por regresión no lineal de la curva de absorbencia en función de la cantidad de antiveneno.

Estadísticos utilizados

Los resultados se expresan como la media y el desvío estándar (D.S.). Se utilizó como estadístico el t de Student por comparación de medias y varianzas. Para la comparación entre grupos se utilizó el estadístico t de Student y el método de Wilcoxon. Las curvas Dosis respuesta se estimaron utilizando el Software Prisma (Graph Pad Software, Inc. San Diego, California, U.S.A.).

Resultados

La reactividad inmunoquímica de los diferentes sueros considerada por ELISA fue en el orden siguiente: 2B (1:100.000) > 4B (1:50.000) > 3BC (1:40.000) > 1C (1:10.000). Los números entre paréntesis representan la mayor dilución de cada suero que resulta positiva en el ELISA con un valor de p < 0.05.
Los valores de las DE50 para la neutralización de la potencia letal del veneno de B. jararacussu por los distintos antivenenos (x.[límites 95% de confianza]) fueron de 8.62 µl [7.0-10.4 µl] para el 2B; 9.5 µl [9.3-9.9 µl] para el 4B (homólogo); 10.1 µl [9.2-11.0 µl] para el 3BC y de 12.2 µl [9.9-15.1 µl] para el 1C.
Los valores de DE50 para la neutralización de las actividades hemorrágica, necrotizante, procoagulante y hemolítica indirecta del veneno de B. jararacussu por los diferentes antivenenos se presentan en la Tabla 1.

Discusión

La reactividad inmunoquímica entre los venenos de los crotálidos americanos es bien conocida5, 6, 9 así como la capacidad de los sueros antiofídicos de neutralizar las actividades enzimáticas y tóxicas de venenos no utilizados como inmunógenos en su preparación6, 7, 10, 13, 16. La reactividad cruzada se debería a la gran similitud en las secuencias de aminoácidos y las estructuras secundarias y terciarias que existe entre proteínas homólogas de venenos, y cuando estas proteínas tienen participación relevante en los mecanismos fisiopatológicos del envenenamiento, se observa neutralización cruzada17, 18.
Comparado con los venenos de otras especies de Bothrops de la Argentina, el veneno de B. jararacussu presenta diferencias en su composición y en la intensidad de sus actividades biológicas. En efecto, 25% de la proteína del veneno está constituido por miotoxinas, proteínas tóxicas de estructura similar a las fosfolipasas A2 pero carentes de actividad enzimática19, 23. Estas diferencias se manifiestan en su elevada potencia letal, acompañada de actividades hemorrágica y proteolítica sobre gelatina 2-4 y 6-20 veces, respectivamente, más bajas que en otros venenos del mismo Género1.
Trabajos previos6, 24 demostraron que los sueros antitóxicos producidos en el país producen reacción cruzada y poseen capacidad neutralizante heteróloga sobre la potencia letal de otros venenos de serpientes de la Argentina. Se estudió la capacidad neutralizante de estos antivenenos sobre las actividades biológicas del veneno de B. jararacussu (la especie potencialmente más peligrosa del país), ya que en la evaluación de los antivenenos deben considerarse no sólo la neutralización de la potencia letal, sino también la de otros efectos fisiopatológicos relevantes, como la lesión local23, 25.
Todos los antivenenos dan reacción cruzada con el veneno de B. jararacussu en el ELISA, cuya intensidad puede cuantificarse en base a la máxima dilución de antiveneno que resulta positiva con un valor de p < 0.05. Así, si la reactividad con el antiveneno 4B (homólogo) se toma como 1.0, ésta resulta 2.0 con el 2B, 0.8 con el 3BC y 0.2 con el 1C. Como se muestra en la Tabla 1, todos los antivenenos estudiados presentan una capacidad neutralizante similar sobre las actividades hemorrágica, necrotizante, procoagulante y hemolítica indirecta, así como sobre la potencia letal del veneno de B. jararacussu.
La capacidad neutralizante de los antivenenos 2B, 4B y 3BC sobre los venenos homólogos (B. alternatus y B. neuwiedii) es aproximadamente la misma, de modo que teniendo en cuenta el alto grado de reactividad inmunológica cruzada entre los venenos botrópicos6, 7, 9, 10, 13, 16, 24 no resultaría sorprendente que esos antivenenos posean prácticamente la misma capacidad neutralizante sobre las actividades biológicas del veneno de B. jararacussu. Por ejemplo, todos los antivenenos neutralizan la hemólisis indirecta con una potencia similar, ya que depende de la actividad de fosfolipasa A2, y si bien las miotoxinas de veneno de B. jararacussu no poseen actividad enzimática ni son hemolíticas per se son ho-mólogos de fosfolipasa A226, 27. Igualmente, la neutralización de la actividad procoagulante por el antiveneno 1C podría explicarse por la similitud estructural de las proteasas procoagulantes presentes en los venenos de C. d. terrificus y B. jararacussu6.
Por el contrario, la inyección intradérmica de veneno de C. d. terrificus en ratones no produce necrosis ni hemorragias. En consecuencia, no existirían en este veneno componentes homólogos que permitan explicar la elevada capacidad neutralizante del antiveneno 1C sobre las actividades hemorrágica y necrotizante del veneno de B. jararacussu.
En efecto, el veneno de C. d. terrificus difiere de los venenos botrópicos tanto en su composición como en su actividad biológica, y su elevada potencia letal (0.2 µg/g) se atribuye a presencia de una fosfolipasa A2 neurotóxica (crotoxina) que constituye alrededor de 50% de la proteína del veneno.
Es difícil explicar la neutralización de la actividad hemorrágica del veneno de B. jaracussu por antiveneno 1C. En cambio, la neutralización de la actividad necro-tizante por este antiveneno podría explicarse por la intensa reacción cruzada de las miotoxinas con F(ab‘)2 anti-crotoxina purificados por cromatografía de afinidad6. Esto indica que las miotoxinas comparten determinantes antigénicos con crotoxina26, 27. Por otra parte, el efecto de las miotoxinas sería más importante que el de la isquemia en la necrosis tisular producida por el veneno de B. jararacussu23, 28-30. De este modo, la neutralización de la actividad necrotizante por los antivenenos 1C y 3BC podría deberse a la presencia de fragmentos F(ab‘)2 anti-crotoxina. De todos modos, la capacidad neutra-lizante del antiveneno 1C no es un artificio ni parece depender de la especie inmunizada o del tratamiento ulterior del suero. Resultados preliminares muestran que la preincubación de veneno de B. jararacussu con suero de conejos inmunizados con veneno de C. d. terrificus (IgG enteras) también es efectiva para neutralizar la actividad hemorrágica.
La actividad neutralizante del antiveneno 1C concuerda con observaciones clínicas26 que sugieren que la adición de 1C al antiveneno homólogo, resulta en un mayor efecto terapéutico en el tratamiento de accidentes humanos producidos por B. jararacussu.
Los resultados presentados sugieren la necesidad de realizar nuevos estudios experimentales y de campo para evaluar la utilidad potencial de los sueros heterólogos en el tratamiento de los accidentes botrópicos. Estos estudios son particularmente importantes en regiones cohabitadas por varias especie del Género Bothrops.
Varios autores recomiendan el empleo de antivenenos específicos25, 31, 32 debido a la variabilidad en la composición antigénica de los componentes del veneno entre especies y aun entre poblaciones de la misma especie. Sin embargo, en la práctica, el tratamiento del accidentado suele hacerse con antivenenos polivalentes, obtenidos a partir de animales inmunizados con mezclas de venenos. Por el contrario, resultaría viable el tratamiento con antivenenos heterólogos obtenidos a partir de inmunógenos seleccionados, que presenten una importante reactividad cruzada con los componentes relevantes del veneno en cuestión.

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TABLA 1

Suero Letalidad Letalidad Hemorragia Necrosis Coagulación Hemólisis
(µl) (mg) (µl) (µl) (incremento indirecta
sobre el control) (µl)

4B 9.5 1.25 4.9 ± 0.9 4.4 ± 1.5 > 16 70.2 ± 25.7
(9.3-9.9) (1.20-1.30)
2 B 8.62 1.15 5.5 ± 0.9 7.3 ± 4.0 > 17 85.2 ± 20.5
(7.0-10.4) (0.94-1.34)
3 BC 10.1 1.10 5.4 ± 4.3 4.4 ± 1.2 > 15 69.5 ± 28.2
(9.2-11.0) (1.00-1.20)
1 C 12.23 1.13 5.7 ± 3.5 5.2 ± 3.2 > 14 84.1 ± 28.3
(9.9-15.1) (0.91-1.38)

La Tabla expresa la Dosis efectiva 50% (DE50) indicada en µl de los antivenenos estudiados frente a diferentes actividades del veneno de Bothrops jararacussu. Las cantidades de veneno utilizadas fueron para la actividad letal ~ 11.0 DL50 intraperitoneales, para la actividad hemorrágica ~ 7.0 DMH (dosis mínimas hemorrágicas), para la actividad necrotizante ~ 3.0 DMN, para la actividad coagulante en plasma ~ 11.0 DMP-P, y de 100 µg para la hemólisis indirecta. Los valores se expresan como la media indicando el intervalo de confianza (ente paréntesis) o como la media con el desvío estándar (media ± D.S.). En la neutralización de la actividad coagulante, los cuatro antivenenos retardaron la formación del coágulo en el plasma tratado más de 14 veces.