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RESUMENES DE LAS COMUNICACIONES ORALES
INMUNOLOGIA III 143. Rol dual del AMP cíclico en la regulación de la apoptosis
tímica inducida por glucocorticoides y el receptor T Lionel Müller
Igaz, Mónica Costas, Eduardo Arzt. Tanto la activación vía el receptor T (TCR) como la exposición a glucocorticoides (GC) causan apoptosis en las células T de manera mutuamente antagónica. Hemos demostrado anteriormente en células Ti-6 que la adrenalina y análogos de cAMP potencian la acción de los GC, y actualmente corroborado ese efecto en otras dos líneas celulares de timoma de ratón (D0-11.10 y 2B4.11) utilizando CPT-cAMP, un análogo estable del cAMP. Dado que los factores modulados por la vía del cAMP podrían participar en la interacción con señales mediadas por el receptor de GC activado, se analizaron por EMSA los cambios en los niveles de activación de los factores de transcripción que se unen a CRE (elementos respondedores a cAMP), en respuesta a CPTcAMP ó CPTcAMP + GC. Se observó la activación de diferentes proteínas pertenecientes a la familia CREB/CREM en respuesta a CPTcAMP, sin presentar diferencias en presencia ó ausencia de GC. También analizamos los efectos que ejercen las señales mediadas por la vía del cAMP sobre la inducción de apoptosis mediante activación del TCR (con anticuerpos anti-CD3). Los resultados obtenidos por los métodos de Naranja de Acridina y citometría de flujo (anexina V) muestran que el análogo de cAMP antagoniza la acción pro-apoptótica del receptor T, con un % de mortalidad a las 16 hs de 59.5 ± 1.1 con anti-CD3 0.1 µg/2x104 cél. y 21.8 ± 6.3 con CPTcAMP 0,5 mM + anti-CD3 (p<0.05). Estos resultados muestran la participación de la vía del cAMP en la regulación de la apoptosis tímica, siendo su rol estimulatorio o inhibitorio dependiendo del estímulo (GC ó TCR).
144. La actividad transcripcional ap-1 dependiente y la
modulacion del proto-oncogen bcl-2 estan involucradas en la apoptosis
mediada por galectina-1. Gabriel Rabinovich1, C Alonso2, C Riera, C
Sotomayor1 RMGal es una galectina-1 purificada de macrófagos de rata capaz de inducir apoptosis de células T. Este efecto fue confirmado por ensayos de fragmentación del DNA genómico y ME. La cuantificación del nivel de apoptosis utilizando TUNEL por FACS reveló que la adición de RMGal a cultivos linfocitarios produjo un incremento de los niveles de incorporación de nucleótidos biotinilados de un 5% a un 33,4%, mientras que en presencia de lactosa el porcentaje de células TUNEL+ disminuyó a 11,8% confirmando la especificidad del efecto. Nosotros también evaluamos la actividad transcripcional dependiente de AP-1 en la apoptosis inducida por galectina-1, mediante geles de retardamiento. Extractos proteicos de cultivos linfocitarios incubados en presencia o ausencia de galectina-1 fueron enfrentados a una sonda radioctiva conteniendo el sitio de unión AP-1. En los cultivos tratados con RMGal se generó una banda de retardo específica a los 30 min, la cual desapareció al introducir una sonda AP-1 no marcada y se restauró por el agregado de un competidor con una mutación en el sitio de unión a AP-1, rigurosos criterios de especificidad. La actividad transcripcional fue confirmada por el incremento de la expresión temprana de c-jun a través de ensayos de Northern blot. Ensayos Western blot revelaron una disminución de bcl-2 en linfocitos expuestos por 6 h a la acción de RMGal. Por otro lado, el análisis de la secuencia reveló 37% de homología entre RMGal y bcl-2 (55 de 92 aa). El presente estudio permite concluir que la apoptosis mediada por galectina-1, es un proceso fisiológico dependiente del dominio de carbohidratos, involucra actividad transcripcional AP-1 dependiente y se halla mediada por eventos asociados a bcl-2.
145. Análisis inmunofenotípitico de Sangre de Cordón. F
Quiroga, H Lejarraga, I Goldaracena, J Rossi, M Zelazko Dada la importancia del análisis de Sangre de Cordón (SC) en el diagnóstico precoz de inmunodeficiencias primarias y su uso creciente en transplante alogeneico, es necesario conocer sus características fenotípicas y funcionales. Describimos las subpo-blaciones linfocitarias y marcadores de activación e inmadurez en 39 muestras de SC y las comparamos con los valores obtenidos de 140 muestras de sangre periférica de niños normales utilizando técnicas standard de marcación de sangre entera; en el caso de CD40L, se activaron las células mononucleares 5Hs con PMA-Io. En SC observamos un menor % de LB, LTgd y coexpresión HLA-DR/CD3 (SC Med=1.5%; niños Med=13.8%); un predominio mayoritario de células naive CD4/CD45RA (SC Med=87.6%; niños Med=76.9%) y CD8/CD45RA (SC Med=93.3%; niños Med=89.8%) y una baja proporción del fenotipo de activación-memoria (CD4/CD45RO -SC Med=26.1%; niños Med=38.2- y CD8/CD45RO-SC Med=9.5%; niños Med=30.8%-). El % CD8/CD38 es alto en todos los grupos. En valores absolutos, SC presenta mayor Nº de células T (CD4 y CD8) y NK, y menor Nº de linfocitos B que el resto de los grupos pediátricos. Al comparar la expresión de CD40L en los grupos ya mencionados y un grupo de 20 adultos, observamos igual % de expresión pero menor intensidad en SC y niños, indicando menor densidad de moléculas por célula. Estas observaciones muestran la inmadurez y baja activación en SC.
146. Diagnóstico definitivo de inmunodeficiencias primarias
(IDP) combinadas y de anticuerpos ligadas al X. S Danielian, G
Basilico, J El Hakeh, M Oleastro, S Rosenzweig, M Zelazko La identificación y caracterización de los genes responsables de la inmunodeficiencia combinada severa ligada al X (X-SCID), del síndrome de hiper IgM (XHM) y de la agamaglobulinemia de Bruton (XLA) permiten analizar las bases moleculares de estas IDP. Objetivo: disponer de un método certero para el diagnóstico de estas IDP y ofrecer asesoramiento genético a las familias afectadas. Materiales y Métodos: se estudiaron 12 pacientes con XLA (7 familias), 1 paciente con X-SCID y 2 pacientes (2 familias) con XHM. Mediante el uso de oligonucleótidos intrónicos amplificamos por PCR cada uno de los exones del gen a estudiar, se analizaron los mismos por SSCP y se confirmó la presencia de mutaciones por secuenciación. Resultados: se identificaron mutaciones diferentes en todas las familias incluidas en el estudio (6 sustituciones puntuales, 2 deleciones, 1 compleja), de las cuales el 50% no han sido reportadas previamente en la literatura. De 17 mujeres estudiadas en estas familias, 10 fueron diagnosticadas como portadoras, pudiéndose además detectar como afectado a un varón asintomático, hermano de un paciente con XLA. Conclusión: mediante un eficiente análisis de mutaciones hemos establecido el diagnóstico molecular de estas IDP en nuestro país.
147. Detección de alergenicidad residual en sustitutos lácteos
empleados en el tratamiento de la alergia a leche de vaca. Docena G,
Rozenfeld P, Fossati CA. El tratamiento consiste en eliminar la exposición al alergeno y
reemplazarlo por otro alimento. El objetivo de este trabajo fue
analizar la presencia de componentes alergénicos residuales en leches
de otros orígenes (cabra, oveja, soja) e hidrolizados parciales y
extensivos de leche bovina. Por SDS-PAGE, inmuno-blotting e
inmunoblotting de inhibición (empleando anticuerpos monoclonales
específicos) se identificaron péptidos, caseínas y proteínas del
suero. Por inmunoblotting y EAST se evaluó la alergenicidad de estos
componentes analizando la presencia de IgE específica en el suero de
pacientes alérgicos a leche de vaca. Mediante ELISA de inhibición se
detectó la presencia de componentes de leche y de reactividad cruzada
en los productos analizados. Estos resultados indican que los
hidrolizados extensivos de caseína contienen escaso poder alergénico
en comparación con los otros sutitutos. Los hidrolizados de suero
contienen restos de b-lactoglobulina y a-lactoalbúmina, mientras que
las leches de cabra y oveja muestran una marcada reactividad cruzada
con proteínas de leche de vaca.. Las leches de soja también
revelaron componentes que cruzan con leche bovina.. Por lo tanto, al
momento de instaurar el tratamiento es importante identificar a qué
alergeno el paciente está sensibilizado y conocer la composición
proteica y alergénica el sustituto a emplear.
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