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RESUMENES DE LAS COMUNICACIONES EN POSTER NEFROLOGIA II 429. Actividad citotóxica de toxina Shiga 2 sobre células
epiteliales de corteza renal humana. Efecto de factores inflamatorios.
Elsa Zotta(1), Gabriel Cao(1), Nesmo Levy yeyati(1), Crisitina
Ibarra(1), Claudia Silberstein(1). El objetivo de este trabajo fue estudiar en cultivos celulares de la corteza renal humana los efectos citotóxicos de toxina Shiga 2 (Stx2) y de factores inflamatorios que se encuentran aumentados en pacientes con Sindrome Urémico Hemolítico (SUH). Se desarrollaron cultivos primarios de células epiteliales de corteza renal a partir de pacientes adultos y pediátricos. Las células se incubaron con distintas dosis de Stx2 (0,7pg/ml-70ng/ml) durante 1-72 hs, en presencia o no de factores inflamatorios. Para evaluar la actividad citotóxica de Stx2 se observó la morfología celular por microscopía óptica, se midió la viabilidad celular y se evaluó la apoptosis por citometría de flujo y microscopía de fluorescencia. En todos los cultivos estudiados, Stx2 produjo una disminución significativa de la viabilidad y alteraciones morfológicas dependiendo de la dosis y el tiempo. Luego de 24 hs, Stx2 estimuló significativamente la apoptosis celular. Los efectos citotóxicos de Stx2 aumentaron significativamente al preincubar los cultivos celulares con lipopolisacárido (1mg/ml); interleuquina-1beta (0,1ng/ml); factor de necrosis tumoral alfa (1ng/ml) ó butirato 2mM. Mientras que las Interleuquinas 6 y 8 no modificaron la activida citotóxica de Stx2. Los resultados indican que la insuficiencia renal producida en pacientes con SUH podría ser debida a un efecto directo de Stx2 sobre las células renales, potenciado por factores inflamatorios. 430. Edad de comienzo y pronóstico de la evolución en
poliquistósis renal autosómica dominante (PRAD). Pablo J.
Azurmendi(1), Adriana R. Fraga(1), Elvira E. Arrizurieta(1), Rodolfo
S. Martín(1). PRAD evoluciona a la insuficiencia renal crónica terminal (IRCT) en tiempos variables. Tanto la incidencia de IRCT como los factores pronósticos en la velocidad de progresión (VdP) no han sido definitivamente establecidos. Se estudiaron pacientes (ptes) con al menos 3 creatininas plasmáticas (Crp) > de 2 mg/dl, n=40 (26 mujeres y 14 hombres), con un tiempo de seguimiento de 6.36 ± 0.85 (x±ES) años (0.85-21) y un total de 436 determinaciones de Crp. La VdP se evaluó por la pendiente de la inversa de la Crp (1/Crp) vs. edad del pte. Crp de 2 y 6 mg/dl fueron consideradas como comienzo de la progresión y necesidad de sustitución de la función renal (IRCT), respectivamente. La sobrevida porcentual sin IRCT fue de 100% a los 35 años, 45% a los 55 y 15% por encima de los 80 años. Dos subpoblaciones pudieron definirse ( <ó= y > 55 años). La VdP fue -0.079 ± 0.01 (n=22) en <ó= 55 años y -0.041 ± 0.01 (n=18) en > 55 años (P<0.01). La edades de comienzo de la progresión en cada grupo fueron 42.51±1.32 y 61.01±2.14 (P<0.01), respectivamente. La tensión arterial media fue de 110.96±2.21 y 112.32±2.44, respectivamente (P NS).En conclusión: 1) la proporción de IRCT en PRAD es significativamente superior al 50% y 2) a edades mayores de 55 años, tanto la edad de comienzo de la insuficiencia renal crónica como la VdP indican un mejor pronóstico. Estos datos podrían ser de utilidad al establecer el pronóstico y al evaluar futuros tratamientos en esta enfermedad. 431. Regulación del metabiolismo de la dopamina renal por la
Angiotensina II. Alicia H. Correa(1), Marcelo R. Choi(1), Pablo
Schvartz(1), María L. Jousse(1), Belisario E. Fernández(2). La excreción del sodio es regulada por la angiotensina II (ANG), el ANF y la dopamina (DA). Vimos que la ANG inhibe la captación de DA en el nefrón. Objetivos: Determinarr el receptor, el mensajero y ver si afecta la liberación y turn-over de DA. Se incubaron cortes de corteza renal in vitro con 3H-DA. Se estimuló con ANG 100nM con bloqueo de captación neuronal. Resultados (dpm.g.10.5 ± ES),n=4-15;*: p<0.05vs control (C);#vsCa-free.(Student-ANOVA-Tukey-Kramer). El efecto de ANG es vía el receptor AT1, inhibido por losartan 1uM (C:11,18± 0,24 vs ANG 100nM: 4,96±0.14 * vs ANG+Los: 10,88±0,23) y en medios privados de sodio pero no de calcio (C: 9,90±0,31 vs Na-free: 6,17±0.46* vs ANG+Na-free: 5,69± 0,52*; Ca-free: 6,85±0,58* vs ANG+Ca-free: 3.80 ±0,10#). El análogo 8 Br-AMPc reproduce el efecto (C: 10,79±0,47 vs ANG: 8,74±0,55 vs 8Br-AMPc: 5,15±0,47 vs ANG+8BrAMPc: 3,56±0,46). La liberación de DA fue tipo extraneuronal no exocitótica, no fue afectada por ANG II, que aumentó el turn-over de DA(pendiente: C-5,9±0,11vs ANG-2.98±0.01*. Conclusiones:1) la captación de DA en riñón es extraneuronal y regulable por ANG que la inhibe vía receptor AT1 y AMPc; 2) Es sodio, calcio dependiente. 3) la secreción de DA es ANG-independiente; 4) parte de la antinatriuresis de la ANG se produce disminuyendo la disponibilidad de DA con subestimulación del receptor D1 y desinhibición de la Na+, K+ ATPasa. La alteración de estos sistemas en la hipertensión arterial puede contribuir a la retención salina. 432. Rol de Angiotensina II y los receptores AT1 sobre la
expresión de fibronectina (FN) en corteza renal y función renal en
ratas con isquemia de 40 minutos y 24 hs de reperfusión. Andrés H.
Barrilli(1), Elena J. Ochoa(2), Alejandra B. Quintana(3), Edgardo E.
Guibert(4), María M. Elías(5). Se describe la evolución de la función renal, expresión de FN en corteza renal de ratas controles e isquémicas tratadas con losartán (L) i.p. en dosis de 0, 40 y 80 mg/kg/día durante 3 días incluyendo el día de instalación de la isquemia por clampeo de la arteria renal izquierda. Después de 24 horas de reperfusión, en jaulas metabólicas con recolección de orina, los animales se anestesiaron, se exanguinaron y se extrajeron los riñones y se separaron las cortezas de las médulas. Se midieron BUN y l VFG y las excreciones de agua , electrolitos y proteínas. En los homogenados de corteza y médula se midió la abundancia de FN por Western Blot y la actividad de proteasas por zimografía en geles de gelatina. Los parámetros funcionales se deterioraron respecto a los controles después de la reperfusión (VFG, ml/min/100g;C=1.20±0.09,n=10; Isq +R =0.23±0.02), la abundancia de FN en corteza renal fue mayor en los riñones con Isq+R (100% vs C) a los Isq.(40% vs C). La administración de L (40) no evitó el deterioro de la función renal medida por técnicas de clearance. Por otro lado, L no modificó significativamente las actividades de metaloproteasas en cortezas de los riñones evaluadas por zimografía. Estos resultados indicarían que AngII condicionaría la expresión de proteínas de matriz sin evitar el daño funcional en este modelo de isquemia-reperfusión. 433. Evolución de la expresión y abundancia de fibronectina
(FN) en un modelo de isquemia y reperfusión en riñón de rata.
Guillermo Petrini(1), Andrés H. Barrilli(2), Esteban Serra(3), Elena
J. Ochoa(4), María M. Elías(5). El objetivo de este trabajo fue estudiar la expresión de fibronectina (FN) por células del tubo contorneado proximal ante un daño isquémico unilateral seguido por un período de reperfusión. Seestudió la expresión del FN-mRNA en túbulos proximales aislados por digestión con colagenasay posterior separación en gradiente de Percoll, de riñones controles (C), con isquemia de 40 minutos (I) y con isquemia de 40 min. seguidos de 24hs de reperfusión (IRE). Un grupo adicional de ratas de los mismos grupos fue utilizado para la detección de FN en homogenados de corteza renal y para la determinación de la función renal por medición de la urea plasmática y por técnicas de clearance. Los resultados indican que si bien los niveles de FN-mRNA en túbulos aumentan después de la isquemia, los IRE no se diferencian de C. Por otro lado las abundancias de FN en homogenados son diferentes siendo C<I<IRE. La función renal permanece alterada (VFG, ml/min/100: C= 1.2±0.09, n=7; IRE 0.30±0.02, p<0.01). Estos datos indican una correlación entre función renal y presencia de FN en un episodio muy temprano de daño isquémico. La normalización de la expresión de FN en los túbulos manteniendo niveles aumentados de la proteína, podría ndicar una falta de respuesta adecuada de la degradación. 434. Activación de calpaina en células corticales aisladas de
rata incubadas con paracetamol (APAP). Laura Trumper(1), Gabriela
Coux(2), Liliana A. Monasterolo(3), Verónica M.C. García(3), María
M. Elías(3). Anteriormente hemos caracterizado las acciones nefrotóxicas de APAP. Calpaina es una proteasa que fue involucrada en el daño celular por algunos tóxicos. Existe en el citosol como proenzima inactiva y se transloca a la membrana en presencia de Ca2+ donde encuentra a sus sustratos preferenciales. Nuestro objetivo fue analizar si calpaina esta involucrada en el daño renal inducido por APAP. Se trabajó con una suspensión de células corticales aisladas (Bertorello A.M. J. Cell Sci, 101:343, 1992) incubadas durante 30 minutos en condiciones controles y con paracetamol 1 (APAP1) y 10 mM (APAP10). La actividad de calpaina se midió en membranas celulares aisladas según una modificación de la técnica de Edelstein (Proc. Natl. Acad. Sci USA, 92:7662, 1995), utilizando el sustrato fluorogénico N-succinil-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC. Se determinó la actividad como la diferencia entre la fluorescencia Ca dependiente e independiente. En APAP10 la liberación de lactato deshidrogenasa fue menor del 12%. En los controles la actividad de calpaina fue= 0.23±0.06 nmol AMC/min.mg prot. Los resultados obtenidos luego de la incubación se expresaron como % respecto del control de cada set de experimentos. APAP aumentó la actividad de calpaina (APAP1= 155±9 %, APAP10 =153±10 %, p<0.05 comparado con el control, n=4). La activación de calpaina sin evidencias de deterioro en la integridad de la membrana celular sugeriría un rol para esta proteasa en el inicio del daño inducido por APAP. 435. Diferencia ligada al sexo en la fluidez de membrana y en la
expresión del transportador de aniones orgánicos (OAT1) en riñones
de ratas Wistar adultas. Anabel Brandoni(1), Jorgelina A. Cerrutti(1),
Nora B. Quaglia(1), Adriana M. Torres(2). Estudios previos indicaron diferencias ligadas al sexo en la depuración de aniones orgánicos. Se estudiaron los parámetros cinéticos del transporte del ácido paraminohipúrico (PAH) en vesículas de membrana apical (BBMV) y basolateral (BLMV) de células renales de ratas Wistar machos (M) y Hembras (H). Se observó en BBMV que las H presentaban un mayor Km y en BLMV una menor Vmax y menor Km. El objetivo de este trabajo fue evaluar la fluidez de membrana en BLMV y BBMV y la expresión del transportador de aniones orgánicos (OAT1). La fluidez de membrana se analizó mediante la técnica de polarización de fluorescencia determinando la anisotropía (r) y la expresión de OAT1 se evaluó empleando Western Blot. Las BBMV provenientes de H mostraron menor ‘r’ (H: 0.1897 ± 0.0012; M: 0.2003 ± 0.0014, P<0.05, n=3). En las BLMV no se observaron diferencias de ‘r’ (H: 0.1951 ± 0.0025, M: 0.1948 ± 0.0038, n=3). Se encontró una disminución de expresión de OAT1 en las hembras (40% inferior a la observada en machos). Conclusiones: la menor expresión de OAT1 en BLMV de las hembras, explicaría la menor Vmax en el transporte de PAH. La mayor fluidez de membrana observada en BBMV de las hembras podría determinar la menor afinidad para el transporte de PAH. Las diferencias previamente descriptas, podrían justificar, al menos en parte, la menor carga secretada de PAH observada en hembras respecto de los machos, como se describió en trabajos anteriores. 436. Efectos de intoxicación crónica con aluminio (AL) sobre
el transporte de aniones orgánicos en cortes de corteza renal de
rata. Marisa Gionotti(1), Néstor Millen(1), María M. Elías(2),
Elena Carrera(3), Stella T. Mahieu(1). En trabajos previos se observó un aumento en la absorción máxima de fosfato en túbulo renal de ratas intoxicadas cronicamente. El objetivo de este trabajo fue analizar si este fenómeno se asocia a cambios en otros mecanismos de transporte renal. Se propuso estudiar el transporte de aniones orgánicos (PAH) tanto en su capacidad de acumularse en cortes de corteza renal (S/M), y su cinética de captación ([PAH]t vs [PAH]m), en condiciones de aerobiosis y bajo atmósfera de N2, utilizando cortes de corteza renal. Además se midió la distribución de los compartimientos acuosos y la concentración intracelular de Na+ y K+. Se trabajó con ratas adultas intoxicadas (3 meses, n:10, T; 0.5 mg Al/100g, ip, 3 veces por semana) y 20 controles, C. Los resultados indican una disminución significativa de S/M (C= 3.06 ± 0.02, n=25; T= 2.26± 0.04, n=12, p<0.001). La velocidad de captación de PAH disminuyó significativamente en T en aerobiosis, pero no mostró diferencias bajo N2. No se modificaron ni el espacio de agua total (C= 80±0.2) ni el de inulina (C= 0.31±0.002) como tampoco los contenidos de Na+ ni K+. Estos resultados sugieren una modificación del mecanismo de transporte de aniones orgánicos no ligado a modificaciones en la distribución de agua y electrolitos, pero que requiere energía. 437. Respuesta de la vasculatura renal de ratas diabéticas a
noradrenalina (NA) en presencia de enalapril (ENA). Verónica M.C.
García(1), Liliana A. Monasterolo(1), María M. Elías(1). Anteriormente hemos descripto que la vasculatura renal de ratas tratadas con aloxano (150 mg/kg, s.c. 7 días antes del estudio) posee mayor sensibilidad a NA y mayor respuesta a angiotensina II (ANG), y que prazosín revierte la respuesta a ANG y losartán disminuye la mayor sensibilidad a NA. Estos resultados no se observaron en los riñones controles. En este trabajo se profundiza el estudio de la relación entre el sistema renina-angiotensina y el noradrenérgico en este estado diabético. En el modelo de riñón aislado y perfundido se agregaron dosis crecientes de NA (0.25-50 nmol) y se registraron variaciones de presión de perfusión manteniendo el flujo constante, en presencia de ENA 1 uM. ENA no modificó la respuesta en los controles (C), mientras que en diabéticos (D) la curva mostró un aumento significativo de la dosis efectiva 50. (DE50 nmol: C: 7.8±0.6 n=5; C+ENA: 5.9±0.9 n=6; D: 3.4±0.2 n=5 *p<0.05 respecto a C; D+ENA: 5.1±0.5 n=4 *p<0.05 respecto a D). Las respuestas máximas fueron similares en todos los grupos. Estos datos indican que en este estado diabético la respuesta vascular renal a NA requiere la integridad de la vía renina-angiotensina, siendo la acción de ANG intrarrenal sobre receptores AT1 el posible mecanismo involucrado en dicha respuesta. 438. Rol de Angiotensina II y los receptores AT1 sobre la
expresión de fibronectina (FN) en corteza renal de rata durante un
período de isquemia de 40 minutos . Andrés H. Barrilli(1), Ester
Saball(2), Marcela Salvarrey(2), María M. Elías(3). Este trabajo se realizó a los fines de estudiar los posibles mediadores de la expresión de FN descripta en riñón durante la instalación de 40 minutos de isquemia total. En ese sentido se trabajó administrando losartán (L), a ratas controles (C) e isquémicas (Isq) que recibieron la droga i.p en dosis de 0, 40 y 80 mg/kg/dia durante 3 días incluyendo el día de instalación de la isquemia. La isquemia unilateral se logró clampeando la arteria renal izquierda. Al final del experimento se tomó una muestra de sangre para determinar los niveles de BUN y los riñones fueron separados antes de liberar el clamp y la corteza y médula se homogenizaron en un medio conteniendo inhibidores de proteasas. A los fines de la comparación semicuantitativa las muestras fueron sembradas en una misma corrida electroforética como C, C+L, C+2L, Isq, Isq+L , Isq+2L. BUN no se modificó en C(n=10), C+L (n=5) y C+2L (n=6) (0.24 ± 0.01 g/l), en Isq el valor fue de 0.42±0.01, n=12, p<0.001 vs C, Isq+L1 fue de 0.265 ± 0.01 (n=5, p<0.001 vs Isq). Igual respuesta se vió en Isq +L2. Los resultados de los Western de FN indicaron que Isq > C y que el tratamiento con L bajó la expresión de la misma a valores comparables a C y aún menores en la dosis mayor. Estos datos están a favor de una participación de AngII sobre receptores AT1 en el estadío isquémico estudiado. 439. Desarrollo postnatal de la médula renal en ratas Wistar.
María G. Márquez(1), Isabel Cabrera(2), Diego J. Serrano(3), Norma
B. Sterin-Speziale(1). El riñón de los mamíferos se encuentra poco desarrollado al nacimiento. La corteza y la papila completan su desarrollo al destete. En éste trabajo se estudió el desarrollo postnatal de la medula renal en ratas Wistar. Se identificaron las células en proliferación por la expresión nuclear de PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) por inmunohistoquimica (células+ en 10 campos, X±ES, n=5). Resultados: Al nacimiento se observan islas de estructuras tubulares en un abundante intersticio, no diferenciándose la zona medular externa de la interna. La proliferación celular del compartimiento tubular es muy activa desde el día 2 (316±22) hasta el día 10 (335±64). A partir del día 11 se distingue la zona medular externa de la medular interna siendo más activa la proliferación en la zona externa que en la interna (381±38 vs 138±33), decayendo progresivamente en ambas zonas hasta la edad adulta (5±1 y 1.7±0.6). La estructura histológica característica del riñón adulto se observa a los 30 días distinguiéndose la franja externa y la franja interna de la zona medular externa. El evento principal a los 5 y 11 días es la remodelación de la matriz extracelular que rodea los túbulos colectores para permitir su crecimiento, con disminución de la proliferación celular (7±2 y 186±29). Conclusión: La morfogénesis renal progresa en forma convergente puesto que la corteza y la papila completan su desarrollo antes que se distinga la franja externa de la interna en la zona medular externa. 440. Detección del cotransportador sodio-glucosa renal (SGLT2)
de rata con isotiocianato de fluoresceína (FICT). Mónica P.
Majowicz(1), Laura V. González Bosc(1), María D.C. Ortiz(1), María
F. Albertoni Borghese(1), María F. Delgado(1), Norberto A. Vidal(1). FICT es un reactivo fluorescente usado para estudiar cambios conformacionales en proteínas. FICT y su análogo no fluorescente, isotiocianato de fenilo (PICT) se unen a grupos épsilon-amino de Lys. Se usó FICT para marcar el SGLT en vesículas de membrana apical de corteza renal (V) de ratas Wistar machos. PICT se usó para marcar grupos amino inespecíficos en presencia de Na+ y glucosa (glu). Las V se pretrataron 30 min a temperatura ambiente con PICT 2mM en buffer pH 9.2 (VPICT). Las V se recuperaron por centrifugación 23000rpm 30 min. Se incubaron 15 min a 22ºC en oscuridad según: A) VPICT + FICT50 uM; B) VPICT + ClNa 100mM + glu 10 mM + FICT50 uM. Se centrifugó 30 min a 23000rpm y se realizó un SDS-PAGE con las VA y B. El gel se reveló bajo luz UV a 490nm y se cuantificó la fluorescencia. En B aumentó la intensidad de las bandas marcadas con FICT(medida como densidad óptica máxima) en un 87% con respecto a A (p<0.05). La posición de la principal banda marcada con FICT y estimulada por sustratos corresponde a un PM aparente de 72kD. Esto demuestra que existen diferencias funcionales entre el cotransportador Na+-glu intestinal (SGLT1) y el SGLT2. Mientras que en el SGLT1 la marcación por FICT se protege en presencia de sustratos a pH 9.2, en el SGLT2 la marcación con FICT es estimulada en presencia de sustratos. Es probable que los sustratos provoquen un cambio conformacional exponiendo residuos ocultos que puedan ser reconocidos por el FICT. 441. Asociación de Perindopril más Indapamida controla el
daño renal en la rata Zucker fa/fa. Jorge E. Toblli(1), Graciela
DeRosa(2), Gabriel Cao(2), Pablo Piorno(1). Diabetes tipo II, obesidad e hipertensión se asocian con deterioro de la función renal por múltiples factores. Nuestro objetivo fue valorar utilidad de un IECA + diuretico (perindopril (PER) + indapamida (IND) (PTX) en la protección del daño estructural renal mediante análisis morfométrico en ratas Zucker (OZR). Machos OZR de 10 semanas, G1(n= 8)= OZR+PTX. y G2(n= 8)= OZR. Durante 6 meses G1 con PTX 1mg/kg/día por sonda. (ratio IND/PER 0,32), y G2 vehículo. Se evaluó: Presión arterial sistólica (PAS), Clearance de creatinina (Cl.cr.), proteinuria (Up). En tejido renal mediante ocular con grilla, retículo y fórmulas establecidas se valoró: Volumen glomerular (VG); Esclerosis glomerular (EG), % Atrofia Tubular (AT) y % Fibrosis intersticial (FI). Se aplicó test de Mann-Whitney con alfa = 0.05, 6to. mes (media ± DS) G1 OZR+PTX G2 OZR p Peso Corporal (g) 591,3 ± 55,2 551,5 ± 81,3 NS Estos resultados sugieren que la asociación PTX otorga un rol protectivo renal a nivel estructural y funcional en este modelo de diabetes, obesidad e hipertensión.
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