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RESUMENES DE LAS COMUNICACIONES EN POSTER INMUNOLOGIA VIII 409. Expresión de CD1 en células presentadoras de antígeno
(CPA) en pacientes con Tuberculosis Pulmonar Activa (TB). Juan M.
Ilarregui(1), Silvia S. de la Barrera(1), Susana B. Fink(1), Ana
García(2), María Saab(2), Eduardo Abbate(3), María C. Sasiain(1),
Marta R. Finiasz(1). Inicialmente, se demostró que los linfocitos T CD4 y CD8 reconocían a los péptidos extraños a través de las moléculas de histocompatibilidad de Clase I y Clase II expresadas en las CPA. Recientemente se ha demostrado que ciertas poblaciones de CPA pueden presentar lípidos y glucolípidos bacterianos en una forma no tradicional mediante el empleo de moléculas pertenecientes a la familia CD1. El objetivo de este estudio fue determinar por citometría de flujo, la expresión de las moléculas CD83, CD1a, CD1b y CD1c en las CPA de pacientes con TB en los estadíos clínicos moderado (M; n=5) y grave (G; n=5). Se obtuvieron células mononucleares por gradiente de Ficoll-Hypaque y se incubaron durante 6 días con IL-4 y GM-CSF (CKs), para generar CD83+, sin y con el agregado de Mycobacterium tuberculosis (Mtub) durante las últimas 18 horas de cultivo. Resultados: Control + CKs: (%) CD83: 25.9±4.3(M), 9.35±3.9(G); CD1a: 12.9±3.9(M), 4.9±1.8(G); CD1b: 20.4±4.7(M), 12.1±2.5(G); CD1c: 24.4±9.1(M), 6.3±0.8(G). Mtub + CKs: (%) CD83: 23.9±2.7(M), 15.6±3.3(G); CD1a: 14.1±5.7(M), 6.2±1.5(G); CD1b: 15.7±5.9(M), 9.0±1.9(G); CD1c: 25.1±7.7(M), 9.8±3.6(G). Los resultados demuestran que los pacientes con TB grave presentan un menor % de CPA CD1+ y una menor capacidad de generar células CD83+, no siendo modificados por el agregado de Mtub. Las diferencias encontradas entre pacientes con TB moderada y grave podrían vincularse con el proceso inflamatorio asociado al estadío clínico de la enfermedad. 410. La IL-9 revierte la inhibición por IL-10 e IL-13 de la
citotoxicidad (Cx) anti-Mycobacterium leprae (M.leprae). Clara
Franco(1), Marta R. Finiasz(1), Silvia S. de la Barrera(1), María H.
Fariña(2), Graciela Pizzariello(2), Jacques Van Snick(3), Jean
Renauld(3), María C. Sasiain(1), Susana B. Fink(1). La IL-9 es una citoquina (CK) tipo 2 cuyo papel en infecciones no ha sido muy estudiado. Anteriormente demostramos que podía revertir el efecto inhibitorio de la IL-4 sobre la Cx anti-M.leprae. Ahora estudiamos qué ocurría con otras CKs inhibitorias de esa función como la IL-10 y la IL-13. Se purificaron células mononucleares periféricas de controles normales (N) y pacientes con lepra (P). Se cultivaron 7 días en presencia o no de M.leprae y/o CKs y se enfrentaron con macrófagos autólogos estimulados al día 6 con M.leprae. Resultados Cx % (media+ ES): IL-10 N (n=5): 26.40±3.25; IL-9: 41.40±6.57; IL-10: 12.8+0.73; IL-9+IL-10: 44.80±6.83 IL-10 P (n=5): 22.20±4.30; IL-9: 19.4±2.90, IL-10: 3.0±1.80, IL-9+IL-10: 15.8±3.4. IL-13 N (n=6): 24.5±1.5; IL-9: 21.83±1.92; IL-13: 8.17±2.33; IL-9+IL-13: 17±2.01. IL-13 P (n=5): 17.8±1.39; IL-9: 17.8±2.48; IL-13: 6.00±1.64; IL-9+IL-13: 15.40±4.01.El efecto es específico en ambos casos ya que se inhibe con un anticuerpo anti-receptor de IL-9. Se observa tanto en N como en P. Aparentemente el interferón gamma estaría involucrado. La IL-9 puede entonces revertir la inhibición de la función citotóxica por IL-10 e IL-13 (como por IL-4), tanto en N como en todos los P. Se destaca esto siendo todas CKs tipo 2 cuya actividad biológica es en general en el mismo sentido. 411. Expresión de co-receptores para el virus de la
inmunodeficiencia adquirida (VIH) luego del cultivo de leucocitos
mononucleares (LM) de pacientes VIH+. Liliana E. Belmonte(1), Maria M.
Bracco(1), Beatriz Ruibal Ares(1). Se estudiaron variaciones en la expresión de los co-receptores
CXCR4 y CCR5 luego del cultivo no estimulado de LM de pacientes VIH+
(LM VIH+). Se analizó por citometría de flujo su presencia en
linfocitos T desde el inicio hasta 20 días de cultivo. Los resultados
indican que CCR5 descendió (p<0.05) tanto en linfocitos CD4+ como
en CD8+ luego de 7 días de cultivo de LM VIH+ (Media+SEM, CCR5/CD4 %:
pre-cultivo 15.6+6; 7 días 6.7+2; CCR5/CD8: pre-cultivo 31+7; 7 días
8+8, n=6) en comparación con LM VIH- (CCR5/CD4 %: pre-cultivo 13.6+1;
7 días 11.5+42; CCR5/CD8 %: pre-cultivo 24.5+3; 7 días 28.5+5, n=6).
Los valores de CXCR4 aumentaron en linfocitos CD4+ y CD8+ luego de 2
días (50-80 % a 98-100%) y se mantuvieron estables a lo largo del
cultivo tanto en LM VIH+ como en LM VIH-. Para comprobar si la
disminución de expresión de CCR5 estaba asociada a la replicación
viral, se infectaron LM VIH- (pre-cultivados por 6 días) con
sobrenadantes de cultivos de LM VIH+. Luego de 3 días de infección
(p.i.) la expresión de CCR5 se redujo en LM CD4+ (pre-infección:
13+2%; 3 días p.i. 2.4+1.2; p<0.01, n=4), recuperándose
parcialmente entre los 7-20 días p.i. (6.5+2). En cambio la
expresión de CXCR4 no varió significativamente. Los resultados
fueron similares en los linfocitos CD8+ y coincidieron con la
replicación viral durante el cultivo. Tanto la interacción deVIH con
el complejo CD4-CCR5, como la liberación de quimioquinas beta post
infección podrían participar en la modulación de CCR5. 412. Modulación de la respuesta inmune innata hacia la
infección vaginal con Herpes simplex tipo 2 por inhibición de la
óxido nítrico sintetasa. Fabián Benencia(1), Gisela Gamba(1),
Hernán Cavalieri(1), María C. Courreges(1), Ernesto J. Massouh(1). Se investigó la respuesta inmune innata en grupos de 10 ratones Balb/c infectados intravaginalmente con 10 exp 6 UFP de herpes simplex virus tipo 2 (HSV-2), cepa G, y a distintos días post-infección (p.i.) se tomaron muestras de vagina y ganglios linfáticos inguinales (GLI) para determinar la cinética de activación de la iNOS mediante un DOT-BLOT. Se observó una activación de la iNOS a nivel GLI a las 24 hs p.i, y al día 3 p.i. se obtuvieron muestras positivas en vagina. Por histología se reveló la presencia de exudado inflamatorio en vagina compuesto primariamente por PMN. Grupos de 10 ratones se trataron vía intraperitoneal (0.5ml) por tres días, a partir del día de la infección, con diferentes concentraciones (0.4, 2 y 10 mg/ml) de aminoguanidina (AG, un inhibidor específico de la iNOS) en PBS. En los ratones tratados se observó una patología más severa (día 3 p.i., controles: 50% de enfermedad, tratados 0.4mg/ml, 75% de enfermedad, p<0.05; 2 mg/ml y 10 mg/ml, 100% de enfermedad, p<0.05) y un aumento en los niveles de PMN en vagina y en lavados vaginales, así como un aumento en los títulos virales en secreciones vaginales y en vagina. Por RT-PCR se observó un aumento en las muestras positivas para RANTES y MIP-2 en los ratones tratados. Se propone que el aumento de los títulos virales generados por el bloqueo de la iNOS induciría un aumento en la expresión de quimiocinas, determinando un aumento en el influjo de PMN con el consecuente agravamiento de la patología vaginal. 413. Análisis del valor inmunoprotectivo de los antígenos
recombinantes de Toxoplasma gondii Rop2 y Gra4 combinados con aluminio
en un modelo murino de infección toxoplásmica. Valentina Martin(1),
Mónica Nigro(1), Sergio O. Angel(1). Los antígenos de las roptrias Rop2 y de los gránulos densos Gra4, del parásito Toxoplasma gondii, se expresaron en Escherichia coli como proteínas de fusión conteniendo seis residuos de histidina en sus extremos N-terminales (rRop2 y rGra4 respectivamente). Con estas proteínas adsorbidas en Al(OH)3 se inmunizaron intramuscularmente ratones hembras C57BL/6. A los 14 días del último refuerzo, los ratones fueron desafiados con 20 quistes tisulares de la cepa Me49 de Toxoplasma administrados por vía oral. Un mes después los ratones fueron sacrificados y se contaron los quistes presentes en cerebro. Los ratones inmunizados con rRop2 mostraron un número de quistes en cerebro (1506 ± 434) similar al grupo control PBS-Al(OH)3 (1170 ± 3550). Por el contrario, los ratones inmunizados con rGra4 mostraron una disminución en la formación de quistes en cerebro (706 ± 125 versus 1583 ± 673 para PBS-Al(OH)3). Los ratones inmunizados con rRop2 y con rGra4 mostraron una respuesta humoral con predominio del isotipo IgG1 antes del desafío, invirtiéndose hacia un predominio de IgG2a un mes después del desafío. Los ratones inmunizados con PBS-Al(OH)3 mostraron sólo la presencia de anticuerpos del subtipo IgG2a contra estas proteínas, y recién en la muestra post-desafío. rGra4 adsorbida a aluminio parecería ser un buen sistema candidato para ser usado en el diseño de una vacuna multiantigénica contra T. gondii, mientras que rRop2 con aluminio tendría poco valor para este mismo uso. 414. Estudio de la modulación de los patrones de citoquinas por
moléculas coestimulatorias y proteínas de señalización en la
tuberculosis humana. Virginia Pasquinelli(1), María F. Quiroga(2),
Liliana Castro Zorrilla(3), Eduardo Abbate(3), Verónica E.
García(1). La tuberculosis (TBC) es la principal causa de muerte mundial causada por una enfermedad infecciosa. Las citoquinas son cruciales en la inmunidad contra M. tuberculosis, y las células Th1 productoras de IFN-g son responsables del establecimiento de una respuesta inmune celular específica. La molécula linfocitaria activadora de señales (SLAM) y la proteína de señalización SAP (proteína de unión a SLAM) participan en la modulación del establecimiento de respuestas de citoquinas Th1/Th2. Se investigó el rol de SLAM y SAP en la infección por M. tuberculosis. La expresión de SLAM en linfocitos de pacientes con TBC fue mayor que en dadores normales. Más aún, la estimulación con M. tuberculosis indujo aumento de SLAM en células T de pacientes con TBC. Además, la respuesta in vitro al antígeno, mostró alta proliferación celular y producción de IFN-g en un grupo de pacientes, y baja proliferación y producción de IFN-g en otro grupo. La estimulación a través de SLAM indujo un marcado aumento de IFN-g en pacientes con fuerte respuesta al antígeno y un moderado incremento de IFN-g en pacientes con débil respuesta a M. tuberculosis. Asimismo, detectamos alta expresión de SAP en células T de pacientes con fuerte respuesta a M. tuberculosis luego de estimulación antigénica, mientras que la proteína no fue detectada en pacientes con débil respuesta a la bacteria. Estos resultados señalarían un rol para SLAM y SAP en la modulación de los patrones de citoquinas producidos por células T en TBC. 415. Efecto de Lactobacillus plantarum sobre una infección por
Pseudomona aeruginosa en un modelo de injuria térmica. Juan C.
Valdez(1), María C. Peral de Portillo(2), Mirta M. Rachid(3),
Gabriela Perdigón(4). La P. aeruginosa afecta a individuos inmunocomprometidos incluyendo a los quemados. La infección involucra interferencias en las señalizaciones de las cel. fagociticas.Se demostró que los lactobacilos incrementan la capacidad fagocitica. Objetivos.: Determinar si L. plantarum modifica la actividad fagocitica en infeccion por Pseudomona Métodos: Ratones Balbc/C quemados grupo( Q) se infectaron con P. aeruginosa (2x10e2UFC) grupo ( Q +Ps), parte de ellos se inocularon 3 d. despues, intralesionalmente con 10e8 L. plantarum cada 2 d. durante 12 d.(Q+Ps+Lb). A los 5 y 15 d. se realizó: 1) Rec. leuc, 2)retrocultivos de la lesion, sangre, bazo e higado. 3) Fagocitosis de L. plantarum y P. aeruginosa por IFI en cél. de la lesion. Result.:1) A los 5 d. se observó leucocitosis con neutrofilia en los grupos estudiados (C=5000, Q=6500). 2) A los 15 d. Q+Ps disminuyó la leucocitosis y neutrofilia, no asi en Q+Ps+Lb donde se incrementó (7500) con disminución de neutrofilia. 3)Las UFC en la lesion se incremento en Q+Ps a los 5 y 15 d. (5d=1,3x10e7, 15 d= 1,6x 10e8) no asi en el grupo Q+Ps+Lb (5d= 6x10e5, 15d=4x10e3). No se detectaron bacterias en sangre, bazo e higado.4) La fagocitosis en el grupo Q+Ps se incremento a los 5d (70%), disminuyendo a los 15 d = 13%. En Q+Ps+Lb a los 5 d (47%) a los 15 d (37%). Conclusiones.: 1) L. plantarum revierte la disminución leucocitaria, 2)reduce la colonización, 3) estimula a mas del doble la fagocitosis a los 15 dias. 416. Activación alternativa e incremento de la replicación de
Trypanosona cruzi en macrófagos murinos estimulados con cruzipaína.
Cinthia C. Stempin(1), Natalia L. Guiñazú(1), Laura Giordanengo(1),
Susana E. Gea(1), Fabio M. Cerbán(1). Cruzipaína (Cz) induce IL10 y urea (por activación de arginasa) en macrófagos (Mo) murinos. IL12 y óxido nítrico fueron inducidos por LPS. En este trabajo estudiamos la relevancia biológica de la interacción de Cz con Mo murinos en la infección con T. cruzi. Se usaron como antígenos: Cz, R13: péptido derivado de proteinas ribosomales P de T. cruzi y LPS. Como fuente de Mo: células J774 y Mo peritoneales de ratones normales. Estudios in vitro revelaron que células J774 estimuladas con Cz y luego infectadas con tripomastigotes (Tp) (4Tp/Mo) desarrollan un número mayor de parásitos (18,8±1,0x105,p<0.05) respecto de las no estimuladas (8,8±3,1x105). Las incubadas con LPS desarrollaron un número menor (1,0±0,7x105,p<0.05) y las estimuladas con R13 no mostraron diferencias significativas. El estudio de iNOS por Western-blot reveló que Cz, a diferencia de LPS, no fue capaz de inducirla. Cz indujo TGF-b en los sobrenadantes de células J774 (2980±241pg/ml,p<0.05 vs células sin estímulo) y de Mo peritoneales (1385±198 pg/ml,p<0.05 vs células controles). Cz no indujo GM-CSF. Cuando se preincubó Cz con IgG de ratón anti-Cz, antes de la infección de los Mo, éstos desarrollaron el doble de parásitos y produjeron el triple de TGF-b respecto de los Mo incubados con Cz e IgG control. En este contexto, los anticuerpos anti-Cz podrían facilitar la infección. Estos resultados sugieren que Cz favorecería la replicación del T. cruzi por inducción de una vía de activación alternativa en Mo murinos. 417. Caracterización de antígenos liberados por Brucella canis
al medio de cultivo. Pablo C. Baldi(1), Victoria Delpino(1), Carlos A.
Fossati(1). Brucella es un patógeno intracelular facultativo que puede evadir el sistema endocítico-lisosomal de los fagocitos. Brucella posee los genes de un sistema de secreción tipo IV (VirB) cuyas mutaciones anulan la capacidad de la bacteria de evadir al lisosoma. Hasta el momento no se han podido detectar los efectores secretados por el sistema VirB. Nuestro objetivo fue tratar de identificar proteínas secretadas por Brucella canis al medio de cultivo en condiciones fisiológicas y de estrés ácido (pH 5.5) y oxidativo (H2O2 150 mM). Se recolectaron los sobrenadantes de cultivo en fase logarítmica, se los concentró 100 veces y se los analizó por SDS-PAGE y Western blot. La bacteria alcanzó la misma tasa de duplicación en todos los medios. En todas las condiciones ensayadas se observaron por PAGE bandas de 11, 14.5, 16, 22, 29, 32, 36 y 56.5 kDa. Todas las bandas fueron reveladas en un Western blot frente a un pool de sueros de pacientes brucelosos. Para determinar si estas proteínas formaban parte de vesículas de membrana externa o blebs (ya descriptos en B. melitensis) se centrifugó a 125 000 x g durante 4 hs. El procedimiento eliminó todas las proteínas salvo la de 36 kDa. Los resultados sugieren que B. canis, al igual que otras brucelas, libera al medio de cultivo blebs conteniendo varias proteínas inmunogénicas. Además, secreta activamente una proteína de 36 kDa, la cual podría ser la primera proteína se secreción descripta en este genéro. 418. Utilización de un anticuerpo monoclonal
anti-Paracoccidioides brasiliensis para la detección de anticuerpos
específicos en pacientes con paracoccidioidomicosis. María
Serradell(1), María L. Cacace(2), Néstor Taranto(2), Ricardo
Negroni(3), Carlos A. Fossati(1). La paracoccidioidomicosis (PCM) es una micosis endémica en una amplia zona de Sudamérica, producida por el hongo Paracoccidioides brasiliensis (PB). El diagnóstico definitivo se realiza a través de la observación microscópica y el cultivo del agente etiológico, sin embargo es posible realizar un diagnóstico serológico de detección de anticuerpos o antigenemia. Nuestro objetivo fue analizar la posible utilidad diagnóstica de un ensayo de ELISA de captura con el anticuerpo monoclonal (AcM) 2C3 anti-PB que reconoce un componente de 63 kDa, y se lo comparó con un ELISA indirecto frente a un extracto citoplasmático del mismo hongo.En ambos ensayos se analizó la presencia de anticuerpos (Ac) específicos en sueros de pacientescon PCM y de pacientes con histoplasmosis (HP). Los valores de corte de los ensayos se determinaron con suero de individuos sanos. Se analizaron 47 pacientes con PCM y 10 con HP confirmadas.El ensayo de captura resultó positivo en 33 de los pacientes con PCM y en 3 de los casos de HP. Notablemente, el ELISA indirecto solo resultó negativo en 2 pacientes con PCM, mientras que en los 55 sueros restantes resultó positivo. Los resultados obtenidos sugieren que para PCM el ELISA indirecto mostraría una mayor sensibilidad, mientras que el ensayo de captura parece ser más específico, lo cual es importante para el diagnóstico diferencial entre PCM y HP. 419. Efecto estimulante de la dehidroepiandrosterona (DHEA)
sobre la respuesta proliferativa in vitro a sonicado de M.tuberculosis
(ST) en pacientes con tuberculosis pulmonar (TB) leve. Carolina
Mahuad(1), Diana Dlugovitzky(2), María L. Bay(1), Oscar Bottasso(1). Previamente demostramos que el tratamiento in vitro con Cortisol (CORT) y DHEA suprime o estimula, respectivamente, la respuesta proliferativa de células periféricas mononucleares (CPM) estimuladas con ST en sujetos sanos respondedores al mismo. Para saber si tales efectos se observan en pacientes con TB, se cultivaron CPM de 7 controles (Co) y 11 enfermos (4 leves -Le- y 7 moderados -Mo-) (47±15 años, media general ± ds) durante 5 días estimuladas con ST en presencia, o no, de CORT (10 -6, 10 -7 M) o DHEA (10 -7, 10 -8, 10 -9 M). Los resultados expresados como, cpm cultivo con ST+hormona/cpm cultivo con ST x 100 (media ± es) fueron: 10 -6 M CORT= Co 37±6, Le 36±12, Mo 37±4; 10 -7 M CORT= Co 67±6, Le 65±14, Mo 61±8; 10 -7 M DHEA= Co 98±9, Le 166±26, Mo 101±11 (Le vs. Co, p<0.01); 10 -9 M DHEA= Co 106±6, Le 144±8, Mo 98±10 (Le vs. Co, p<0.005). Los estudios combinando CORT y DHEA (un conocido antagonista) en diferentes concentraciones mostraron que la inhibición provocada por CORT, tanto en Co como en TB, no se revirtió con ninguna dosis de DHEA, si bien los Co tendieron a mostrar una recuperación parcial de la blastogénesis en presencia de ésta. La respuesta inespecífica ante Concanavalina A apareció significativamente deprimida en todos los pacientes (p<0.001). El efecto estimulante aislado de la DHEA sobre la linfoproliferación en TB leve podría tener relevancia en los mecanismos de inmunoregulación extrínsecos teniendo en cuenta la acción facilitadora Th1 de esta hormona. 420. Infección in vitro con Trypanosoma cruzi en macrófagos
peritoneales (MP) de ratones sometidos a un protocolo de
desensibilización al LPS. Ana Pérez(1), Maximiliano Tamae Kakazu(1),
Eduardo Roggero(1), Jeanne Wietzerbin(2), Oscar Bottasso(1). Dado que el pretratamiento con LPS modifica la funcionalidad de los macrófagos y los hallazgos previos de que los MP de animales pretratados con dicha endotoxina son más permisivos a la multiplicación del Tc, nos propusimos analizar una serie de mediadores sintetizados por dichas células de relevancia en esta tripanosomiasis. Se obtuvieron MP de ratones C57BL/6 adultos, controles (Co, n=5) o pretratados (una inyección i.p. de LPS 2µg/vez, 4 días consecutivos, más una dosis de 200µg al día 5, en simultáneo con inyecciones de pentoxifilina (puede atenuar el estado de tolerancia) 2mg/ratón/vez en los mismos intervalos (LpsPtx, n=5). Los MP se recogieron 3 días después y se cultivaron en placas, 3 x 105 células/pozo (MEM suplementado). Luego de 2 hs, los MP fueron expuestos a Tc de la cepa Tulahuén relación parásito-célula 1:1 durante 48 h. Los resultados de las mediciones de factor de necrosis tumoral alfa (FNT), interleucocinas 10, IL-1 beta y nitritos en sobrenadantes de 48 hs de cultivo fueron (media ± es): FNT Co 1038±163 (pg/ml) LpsPtx 112±31.7 (p<0.01), IL-10 Co 147±39, LpsPtx 835±302 (p<0.025), IL-1 Co 66±28.6, LpsPtx 22.6±9.5 (p<0.025), nitritos (µM) Co 56.3±27, LpsPtx 36.4±14.8. La comparación en sobrenadantes de 24 hs de cultivo arrojó un patrón similar de resultados. El pretratamiento con LpsPtx altera la síntesis de citocinas del macrófago favoreciendo la producción de mediadores inactivadores que podría explicar el mayor número de amastigotes observado previamente. 421. Análisis discriminante de la respuesta linfoproliferativa
de células periféricas mononucleares (CPM) de pacientes con artritis
reumatoidea (AR) ante la estimulación con antígenos micobacterianos.
Flavia Rondelli(1), Daniel Wojdyla(1), Mario Goñi(1), Bernardo
Pons-Estel(1), Alberto Gentiletti(1), Carolina Mahuad(1), Oscar
Bottasso(1), María L. Bay(1). Previamente demostramos que los pacientes con AR tienen una baja respuesta proliferativa al estimular sus CPM con extractos solubles de 13 especies de micobacterias medioambientales. Para analizar si esta alteración se relaciona con parámetros clínicos de la AR, se efectuó un análisis discriminante que permite derivar una nueva variable como combinación lineal de variables cuantitativas (índices de estimulación -IE- para c/antígeno); donde las blastogénesis deprimidas se reflejan en valores negativos. Se estudiaron 29 pacientes con diagnóstico de AR sin inmunosupresores y 28 controles (Co), similares en sexo, edad (46±12 años, ds) y cicatriz de BCG. Las CPM se cultivaron 5 días y los IE se utilizaron para generar 2 nuevas variables, correspondientes a estímulos con antígenos de micobacterias de crecimiento rápido (R) o lento (L). La reducida blastogénesis de los AR hizo que las 2 funciones presentaran valores cuantitativamente inferiores a los Co (R, p=0.04 y L p=0.003). Al comparar distintos parámetros clínicos (erosiones, número de articulaciones y tiempo de evolución), los casos con enfermedad relativamente reciente presentaron resultados más negativos en la variable R respecto de los pacientes con mayor antiguedad (<24 meses -0.649, >24 meses -0.174, p=0.05). El hecho de que los pacientes más recientes tienden a presentar mayor actividad de la AR, haría suponer que el defecto descripto se relaciona con trastornos inmunorregulatorios vinculados a esta última variable. 422. Supresión de respuesta artrítica en ratas crónicamente
infectadas con Trypanosoma cruzi (Tc) y su relación con una baja
producción in vitro de citocinas con acción inflamatoria. Griselda
Dídoli(1), Flavia Rondelli(1), María L. Bay(1), Oscar Bottasso(1). Trabajos previos en ratas ‘l’ infectadas crónicamente con Tc muestran una respuesta artrítica (AA) deprimida ante el desafío con Adyuvante Completo de Freund (pata trasera derecha), que se revierte dando ciclofosfamida (Cy) 48 hs antes de la inducción. Dado los efectos inflamatorios del factor de necrosis tumoral alfa (FNT) y la IL-12 se evalúan sus niveles en los sobrenadantes de cultivo (36 hs) de células del ganglio poplíteo drenante, estimuladas con Concanavalina (ConA) o sonicado total de M. tuberculosis (ST); de ratas con 90 días de infección con Tc y controles similares (Co), tratadas con Cy (25 mg/kg) o fisiológica (48 hs antes de inducir la AA). Las mediciones por ELISA (media ± es, pg/ml, n=4-5/grupo) al día 0 (inducción de AA) mostraron niveles muy bajos de IL-12 en todos los cultivos con valores bien evidentes de FNT sin diferencias entre grupos (estimulados con ConA o ST). Pico de la AA (15 días después), FNT, ST= Co 207.5±68, Co+Cy 166.8±30, Tc 115±16, Tc+Cy 370.9±145 (Tc vs Tc+Cy, p=0.02); ConA= Co 835±111.2, Co+Cy 738.3±145, Tc 700±124, Tc+Cy 1158±148 (Tc vs Tc+Cy p<0.05). IL-12, ST= Co 7.8±2, Co+Cy 7.3±0.7, Tc 10±2.4, Tc+Cy 13±2.7; ConA= Co 18.3±3.4, Co+Cy 19.8±3.6, Tc 19.9±3.4, Tc+Cy 35±4.2 (p<0.05). Se midieron los niveles de nitritos sin diferencias entre grupos. El restablecimiento ya conocido de la AA en el grupo Tc+Cy se asocia a una recuperación en los valores de FNT y en menor grado a un incremento en los niveles de IL-12, en las ratas artríticas. 423. Inducción de Apoptosis por Glucuronoxilomanano de
Cryptococcus neoformans en Esplenocitos de Ratas Normales. Laura
Chiapello(1), Pilar Aoki(1), Susana Castillo(1), Héctor
Rubinstein(1), Diana T. Masih(1). El objetivo de este trabajo fue determinar si el principal polisacárido capsular de Cryptococcus neoformans, glucuronoxilo-manano (GXM), induce apoptosis en esplenocitos in vitro y estudiar si durante el período inmunosupresor de la infección experimental en ratas con el hongo se induce apoptosis en los órganos infectados. Para ello se determinó la fragmentación del ADN por electroforesis en gel de agarosa al 2% y reacción de TUNEL en esplenocitos de ratas normales cocultivados con GXM (50mg/ml) por 24 h a 37°C y 5% de CO2. Se observó que GXM indujo el clivaje del ADN en fragmentos de tamaño oligonucleosomal y reacción de TUNEL positiva en extendidos de las células de cultivo. El análisis por citometría de flujo de los esplenocitos marcados con ioduro de propidio demostró que en presencia de GXM se observa un aumento de aproximadamente 30% de ADN subdiploide. Por otra parte la reacción de TUNEL reveló niveles aumentados de apoptosis en secciones de pulmón y bazo de ratas infectadas con C. neoformans (período inmunosupresor). En pulmón se observó apoptosis de células con características de macrófagos histiocitarios, células fundamentales para la eliminación del hongo. Se puede concluir que GXM induce muerte celular programada en esplenocitos de ratas normales in vitro, y en animales infectados con C. neoformans se observa apoptosis durante el período inmunosupresor. La participación de GXM en la muerte celular durante la infección se está investigando actualmente. 424. IL-4 rescata de la apoptosis a linfocitos B de ratones
infectados con Trypanosoma cruzi. Eva V. Acosta Rodríguez(1), Elina
I. Zúñiga(1), Carolina L. Montes(1), Adriana Gruppi(1). La fase aguda de la infección con T. cruzi se caracteriza por una inmunosupresión generalizada que ha sido asociada a una masiva apoptosis de LiT o LiB. Dilucidar los mecanismos involucrados en el rescate de LiB aportaría datos para diseñar estrategias que favorezcan el desarrollo de una respuesta humoral protectora. Con el objetivo de identificar señales que rescaten de la muerte a los LiB de ratones infectados, evaluamos el efecto de IL-4. Para ello, LiB purificados de ratones normales (BN) o infectados (BI) fueron cultivados con o sin IL-4. Luego de 18hs de cultivo observamos mediante FACS que IL-4 (25ng/mL) inhibe la apoptosis de BN (65%) y de BI (55%) sin inducir proliferación (determinada por la ausencia de incorporación de H3-Timidina). IL-4 rescató de la muerte a LiB IgM (42%BN-62%BI) e IgG (72%BN-60%BI) aunque no modificó la concentración de isotipos de Igs en sobrenadantes de 96 hs de cultivo de BN o BI. IL-4 no modificó la expresión de las proteínas antiapoptóticas Bcl-2 ó Bcl-xL ni la expresión de Fas de superficie en BN o BI. Sin embargo, disminuyó un 50% la expresión de FasL en BI indicando que, dado que los BI cometen fraticidio via Fas/FasL, la disminución en la expresión de FasL podría ser responsable del rescate de BI inducido por IL-4. Considerando que IL-4 incrementa la expresión de MHCII en BI y BN, y que el transactivador de clase II (CIITA) está involucrado en la disminución de FasL, es posible que este factor sea clave para el rescate mediado por IL-4. 425. Modificación de la inmunocompetencia del macrófago por
efecto del estrés. Implicancias en la progresión de la infección
por Candida albicans. María C. Rodriguez-Galán(1), Claudia E.
Sotomayor(2), María E. Costamagna(3), Ana M. Cabanillas(3), Beatriz
M. Salido Renteria(2), Ana M. Masini-Repiso(3), Silvia G. Correa(2). La actividad fungicida de los fagocitos es uno de los principales mecanismos efectores en la infección por C. albicans, aunque la función de los macrófagos (Mf) es aún discutida. Nuestro objetivo fue evaluar la inmunocompetencia del Mf luego de la exposición a 3 días de estrés y su implicancia en la progresión de la infección. Ratas Wistar se infectaron ip (3 x 108 lev, grupo Ca) o se infectaron y estresaron durante 3 días (grupo CaE). Animales normales y sólo estresados se usaron como controles. En el sitio de la infección el número de UFC fue mayor en el grupo CaE (p<0.03) asociado a una menor actividad fungicida de los Mf (p < 0.03). En estas células, la infección activó el metabolismo de la arginina, pero la exposición al estrés moduló negativamente la producción de NO (p< 0.05), de urea (p<0.05) y la expresión de la iNOS luego de la reestimulación in vitro con el hongo. Tanto la producción de TNF-a como el balance IL-1ra/IL-1 luego de la reestimulación in vitro con el hongo resultaron disminuídos en el grupo CaE (p<0.05). Estos resultados muestran el profundo efecto del estrés sobre la función del Mf y revelan la importancia de esta célula en el control local y temprano de la infección por C. albicans. 426. Marcada hepatotoxicidad durante la infección por Candida
albicans luego de exposición al estrés. María C.
Rodriguez-Galán(1), Silvia G. Correa(2), Roxana Cano(3), Beatriz M.
Salido Renteria(4), Nora L. Yranzo(2), Claudia E. Sotomayor(5). Ratas Wistar infectadas con C.albicans (3x 108 lev,grupo Ca) y expuestas a un esquema de estrés(E) de 3 días(grupo CaE) presentan un marcado deterioro de la respuesta inmune local y una mayor suceptibilidad a la infección. Nuestro objetivo fue evaluar las modificaciones de parámetros sistémicos claves en este modelo, profundizando el estudio a nivel hepático, puesto que el hígado constituye una de las primeras barreras protectoras contra microorganismos intestinales y desempeña un rol importante en la prevención de la patología sistémica. En los animales CaE, se detectó un aumento sérico de la corticosterona(p<0.05), hiperplasia de la glándula adrenal(p<0.001) y disminución del peso del timo(p<0.02) respecto a ratas normales. La mayor colonización hepática estuvo asociada a una respuesta inflamatoria pobre en el grupo CaE. Estudios histopatológicos revelaron hiperplasia de las células de Kupffer (ED2+, IA+) luego de la infección; aparición de esteatosis microvesicular difusa en el grupo Ca, y esteatosis mixta (macro-micro) localizada en la zona acinar 1 en el grupo CaE. Mientras que la infección provocó una marcada peroxidación lipídica (aumento en el nivel de malondialdehido), la aplicación del E exacerbó este fenómeno(p<0.05). La actividad sérica de ALT y g-GT(p<0.05) estuvo aumentada en el grupo CaE. En este modelo el hígado se comporta como órgano blanco, reflejando la mayor suceptibilidad a la infección por C.albicans luego de la exposición al estrés. 427. Efecto del péptido sintético, análogo al extremo
C-terminal de la glicoproteína gp90 del virus de la anemia infecciosa
equina, sobre el balance de citoquinas tipo1/tipo2. Adriana
Soutullo(1), María I. García(2), Andrea L. Racca(2), Georgina
Tonarelli(3), Javier Lottesberger(3), Ileana Malan Borel(2). El virus de la anemia infecciosa equina es un lentivirus causante, en los animales, de infecciones persistentes con pérdida del rendimiento muscular. Uno de los componentes virales es una glicoproteína de superficie, gp90 involucrada en la entrada del virus a la célula. La evolución de la enfermedad dependerá del equilibrio entre las replicaciones virales y los mecanismos inmunológicos. En este trabajo se analizó el efecto del péptido análogo a una región conservada de la gp90, sobre la inducción de citoquinas y síntesis de anticuerpos anti-gp90. Para ello grupos de ratones fueron inoculados con 0, 20 (bajas dosis) y 100mg (altas dosis) del péptido, cada 15 días, durante 120 días. Los animales fueron sangrados para analizar, por ELISA, los niveles de INFgamma, IL-4 y anticuerpos. Los resultados mostraron un aumento en los niveles de INFgamma a partir del día 20 en los animales inoculados con bajas (18.3±14.3 pg/ml) o altas dosis (25.6±6.25 pg/ml) respecto del control (9.6±1.17 pg/ml). La máxima diferencia entre ambos grupos se observa a los 92 días, 44.2±38.35 pg/ml para 20ug y 27.7±16.38 pg/ml para 100ug. No habiendo diferencias en los niveles de IL-4 entre los grupos analizados (P>0.05). La producción de anticuerpos fue observada en el grupo altas dosis (tìtulo1/16000) a partir del día 48. El péptido analizado sería capaz de desencadenar una respuesta inmune favorable a la eliminación del virus, estimulando la síntesis de citoquinas tipo1 y de anticuerpos. 428. Estudio de la funcionalidad de macrófagos en ratones
knockout en TNFRp55 o IL-12p40 infectados con Yersinia enterocolitica
O:8. Maria S. Di Genaro(1), Ana M.S. Guzman(1), Ingo B. Autenrieth(2). Yersinia enterocolitica es una bacteria enteropatogénica altamente virulenta en ratones C57BL76 knockout en TNFRp55 (TNFRp55-/-) o IL-12 (IL-12p40-/-). El objetivo del presente trabajo fue investigar la funcionalidad de macrófagos TNFRp55-/- e IL-12p40-/- frente a una la infección con Yersinia. Se estudió la actividad microbicida de macrófagos peritoneales de ratones TNFRp55-/-, IL-12p40-/- y C57BL/6 normales infectados in vitro con Y. enterocolitica O:8 (moi=100:1 y 10:1) luego de 90 minutos de incubación. En macrófagos peritoneales aislados 3 días postinfección con Y. enterocolitica (1 x 103 CFU por vía i.p.), se analizó la expresión de RNAm de iNOS, JE, IL-12p40 e IL-10 por RT-PCR. Los valores fueron expresados como la relación de la intensidad de las bandas con respecto a beta-actina. Se observó que el porcentaje de muerte intracelular de Yersinia en macrófagos TNFRp55-/- fue significativamente menor (11-27%) comparado con macrófagos normales (65-85%) (p<0.05). Un aumento significativo en la expresión de RNAm de iNOS, JE e IL-10 fue detectado en macrófagos TNFRp55-/-. No se observaron diferencias significativas en la funcionalidad de macrófagos IL-12-/-. De los resultados puede concluirse que macrófagos deficientes en TNFRp55 presentan, a pesar de la up-regulación de iNOS, una alteración en su capacidad microbicida frente a Yersinia. Este defecto se debería a un aumento de la expresión de IL-10, citoquina desactivante de macrófagos.
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