Alicia S. Lorenti

Instituto de Ciencias Básicas y Medicina Experimental, Hospital Italiano, Buenos Aires

Resumen

La existencia de células progenitoras hepáticas ha sido discutida durante mucho tiempo, hasta que diversos estudios sobre la patogénesis de las enfermedades hepáticas, revelaron su existencia. Los hepatocitos que forman parte del parénquima muestran diferencias morfológicas, bioquímicas y funcionales, así como también en su capacidad de proliferación y en los patrones de expresión de genes. Los hepatocitos y las células ductales biliares tienen un origen embriológico común: las células endodérmicas multipotenciales, que migran y se diferencian por señales recibidas del mesénquima portal. La regeneración hepática se produce normalmente a través de la activación de células maduras. Cuando el daño hepático es demasiado extenso, se produce la activación de células progenitoras ubicadas en el canal de Hering, que dan origen a las células ovales. Hay marcadores antigénicos específicos de estas células, y otros compartidos con células fetales. Existen en el hombre células con características similares a las ovales descriptas en roedores. Una nueva dimensión en este tema, es el hallazgo de la obtención de células hepáticas a partir de células progenitoras de médula ósea. En este sentido, fueron realizados diversos trabajos con modelos animales y también en el hombre. Estos trabajos, así como otros referidos a obtención de otros tipos celulares a partir de médula ósea, indicarían que las células hematopoyéticas podrían ser células itinerantes, capaces de sufrir una diferenciación específica de tejido. El proceso de activación de células progenitoras para generar nuevos hepatocitos y células ductulares biliares, tiene fundamental importancia en temas relacionados con la patofisiología del hígado, como el cáncer y la reparación del parénquima hepático masivamente destruído.

Palabras clave:células progenitoras, hepatocitos, regeneración hepática, células ovales

Abstract

Hepatic stem cells. The presence of hepatic stem cells had been postulated for a long time, until se- veral papers on the pathogenesis of hepatic diseases have recently revealed their presence. Hepatocytes belonging to liver parenchyma show morphological, biochemical and functional differences, as well as different proliferation capacity and pattern of gene expression. Hepatocytes and ductal biliar cells have a common embryologic origin: the endodermic multipotential cells, that migrate and differentiate in response to signals received from the portal mesenchyma. Hepatic regeneration is normally produced through activation of mature cells. However, when the hepatic damage is very extensive, the activation of facultative stem cells localized in the Hering canal, produces the oval cells, with bipotential capacity. Specific antigenic markers for these cells and others shared with fetal cells have been developed. Cells with characteristics similar to those oval cells described in rodents were found in the human liver. A new insight on this subject has opened up with the obtention of hepatic cells from bone marrow stem cells. In this sense, several experiments were carried out using animal and human models. These and others performed with different cellular types obtained from bone marrow, indicate that hematopoietic stem cells could be itinerant cells subject to tissue specific differentiation. The activation of stem cells in order to generate new hepatocytes and ductal biliar cells, is relevant in terms of the study of the pathophysiology of several diseases, such as cancer or the regenerative activity of hepatic parenchyma after masive destruction.

Key words:stem cells, hepatocytes, hepatic regeneration, oval cells

Dirección postal: Dra. Alicia Lorenti, Hospital Italiano, Potosí 4240, 1199 Buenos Aires, Argentina. Fax: (54-11) 4959-0200 e-mail: alorenti@hitalba.edu.ar 

Recibido: 2-V-2001 Aceptado: 2-VII-2001

Durante varias décadas, los investigadores han dudado acerca de la existencia real de células progenitoras hepáticas. Es a partir de los últimos años, que esas dudas comenzaron a despejarse, a partir de evidencias surgidas de estudios en ratas, y del desarrollo de la biología celular aplicada a la patogénesis de las enfermedades del hígado humano. Además, nuevos y excitantes hallazgos indicarían que en algunos órganos, como el cerebro y médula ósea, residirían células con capacidad para diferenciar en diferentes tipos celulares hepáticos.

Estructura del parénquima hepático adulto

La unidad estructural y funcional del parénquima hepático es el acino, el cual está construído alrededor del tracto portal y la vena central. Está formado por seis grupos de tractos portales, cada uno con una vénula portal, una arteriola hepática y un ducto biliar, ubicados alrededor de la vena central. La sangre fluye desde las vénulas portales y las arteriolas hepáticas, en el tracto portal, a través de los sinusoides que rodean las placas de hepatocitos, hasta la vena central.
Desde el punto de vista celular, el hígado está compuesto fundamentalmente por células epiteliales, entre las cuales los hepatocitos constituyen la fracción más abundante, y una fracción menor, que corresponde a las células que forman los ductos y dúctulos biliares1. Los hepatocitos están organizados en placas del espesor de una sola célula, y de 0.3-0.5 mm de longitud, conteniendo hasta 20 células, como se muestra esquemáticamente en la Figura 1. Las placas están rodeadas a ambos lados por endotelio sinusoidal. Los hepatocitos muestran marcadas diferencias morfológicas, bioquímicas y funcionales, según su localización en las placas. Son más pequeños cerca del tracto portal, y van aumentando en su tamaño, cuanto más cerca están de la vena central. También hay variaciones en los patrones de expresión de genes dentro del acino, como así también en la ploidía y el potencial de crecimiento. Los hepatocitos cercanos al tracto portal son diploides y muestran el mayor potencial de crecimiento. En la zona intermedia, entre el tracto portal y la vena central, son tetraploides y con capacidad de crecimiento intermedia. Cerca de la vena central son tetraploides u octaploides, y su capacidad de crecimiento es mucho menor. Un modelo de explicación para este tipo de patrón celular, tiene que ver con la maduración celular, en la cual las células progenitoras están localizadas en, o están muy cercanas a los dúctulos biliares o canales de Hering, también conocidos como colangiolos, y van sufriendo un proceso de diferenciación terminal unidireccional que termina en la vena central2,3.

Crecimiento embrional y posnatal del hígado

Los hepatocitos y las células epiteliales del ducto biliar tienen un origen embriológico común, a partir de una célula fundadora: el hepatoblasto, que a su vez deriva de células endodérmicas multipotenciales encontradas en el divertículo hepático, que aparece como un engrosamiento del intestino anterior adyacente al corazón en desarrollo y proyectándose en el septo transverso4. El desarrollo del hígado a partir del divertículo depende de interacciones entre las células endodérmicas y el mesodermo que las rodea. Esta interacción es indispensable para la formación del hígado. Los hepatoblastos (bipotenciales) migran a través del septo transverso, y comienzan a diferenciarse, regulados por las señales que reciben del mesénquima portal: los hepatoblastos que no están en contacto con el mesénquima diferencian en hepatocitos, y en el caso de las células que están en contacto con el mesénquima del tracto portal, diferencian en células ductales biliares. La Figura 2 muestra esta secuencia temporal en el desarrollo embrionario del hígado de rata. En dicho esquema puede verse también la ubicación del canal de Hering, que contiene células incompletamente diferenciadas, que retienen la capacidad bipotencial para diferenciar en hepatocitos y en células epiteliales biliares5, 6.

Regeneración hepática

El hígado adulto es un órgano esencialmente quiescente, que tiene capacidad de regeneración después de una injuria o resección quirúrgica. De hecho, mucho de lo que se sabe acerca de la regeneración del hígado deriva de los clásicos modelos experimentales de resección de dos tercios de la masa del hígado. El proceso comienza con la activación de la proliferación de hepatocitos maduros (quiescentes hasta ese momento) en primer término, y más tardíamente, de otros tipos celulares, como las células epiteliales biliares, y las endoteliales sinusoidales7, 8. Sin embargo, si el daño hepático es demasiado extenso, ya sea por injuria tóxica o hepatec-tomías parciales reiteradas, y si se inhibe la entrada de los hepatocitos maduros en el ciclo celular por carcinó-genos o hepatotoxinas, la regeneración hepática se produce a través de la activación de células progenitoras hepáticas, que dan origen a las llamadas células ovales. Estas células tienen capacidad clonogénica (capacidad de proliferación) y bipotencial (capacidad de diferenciarse en dos tipos de células: linaje hepatocitario y epitelial biliar)9. En el hígado adulto, el compartimiento de células ovales se activaría sólo cuando la capacidad proliferativa de las células parenquimatosas se ha agotado. En la Figura 3 se ilustra la hipótesis del desarrollo de células ovales a partir de células progenitoras facultativas localizadas en el canal de Hering.

Células ovales

Las células progenitoras hepáticas han sido reconocidas en diversos modelos animales10. El nombre, células ovales, surge de observaciones hechas en trabajos en roedores, en los que se visualizaron como células de forma oval, conteniendo un núcleo ovalado, y una alta relación núcleo-citoplasma.
El concepto de células ovales comenzó a ganar importancia a partir de estudios de carcinogénesis. Ratas expuestas a un amplio rango de carcinógenos muestran un patrón marcadamente uniforme de cambios, que terminan en el desarrollo de un carcinoma hepatocelular: necrosis diseminada e inflamación, seguidas por la proliferación de hepatocitos. Concomitantemente, comienza, en la zona del tracto portal, la proliferación de células pequeñas, de citoplasma escaso, núcleo ovoide: las células ovales. El análisis del desarrollo del hígado y los estudios de poblaciones celulares durante la carcino-génesis, proveyeron los elementos para localizar estas células progenitoras en los canales de Hering en el hígado adulto normal 11. Las células ovales se originan en esta región, e invaden el parénquima completo. A medida que ellas proliferan aparecen pequeños núcleos de hepatocitos pequeños, altamente basófilos entre ellas. Las células ovales van desapareciendo en la medida que el parénquima es gradualmente reconstruído5. Las células ovales en proliferación comprenden un grupo heterogéneo de poblaciones, por lo cual se lo ha llamado “compartimiento de células ovales” 3. Este compartimiento, además de las células ovales, contiene células en transición, que fueron identificadas por características morfológicas, como intermedias entre células ovales y hepatocitos, como también células con características de ductales biliares12, y una variedad de células mesen-quemáticas. Algunas células ovales expresan marcadores antigénicos característicos de células progenitoras, así como otros típicos de los hepatocitos y del epitelio biliar adulto. Específicamente las células ovales expresan algunos marcadores de las células epiteliales del hígado fetal, incluyendo citoqueratinas 7 y 19, alfa-fetoproteína, débilmente albúmina, y OV-6. Han sido desarrollados anticuerpos monoclonales para identificar antígenos de células ovales13. Usando estos anticuerpos (OC2 y OC3), se han identificado, en hígados normales, poblaciones de células antigénicamente relacionadas a células ovales. Estos antígenos, así como otros determinantes antigénicos de superficie, son compartidos entre las células ovales y las células progenitoras hemopoyéticas, incluyendo c-kit, CD34 y Thy-1 en roedores, y c-kit y CD34 en humanos14-18.
La presencia en el hombre, de células similares a las mencionadas en roedores, ha sido un tema de intenso debate2, 8, 19. En el hígado humano fetal en desarrollo, la diferenciación de hepatoblastos está regulada por señales surgidas del mesénquima portal. Los hepatoblastos que no están en contacto con éste, maduran en hepato-citos diferenciados. Si bien es conocida la naturaleza bipotencial de los hepatoblastos, no ha sido demostrada su capacidad clonogénica, de modo que no se las puede equiparar a células ovales o progenitoras20. La identidad de células progenitoras hepáticas en el hígado adulto nor-mal, y su participación en respuesta al daño hepático, ha sido puesto de manifiesto en diversas publicaciones21, 22. Más aún, se han identificado células ovales en hepato-blastoma, carcinoma hepatocelular e hígado cirrótico humanos, mediante marcadores originalmente demostrados en células ovales de rata, incluyendo OV-6. Usando técnicas de doble marcación, se demostró que algunas de estas células co-expresaban marcadores fenotípicos hepatocitarios o biliares14, 23.
Nuevos enfoques de regeneración hepática

Durante varias décadas se dudó de la existencia de las células progenitoras hepáticas. Por qué debería pensarse en la existencia de tales células, si las células maduras diferenciadas del hígado, naturalmente quiescentes, retenían la capacidad de entrar nuevamente en el ciclo celular, dividirse y diferenciarse nuevamente, en respuesta a una injuria tóxica o quirúrgica. Es decir, que la masa normal del hígado puede ser completamente restaurada sin que sea necesaria la contribución de células progenitoras. Sin embargo, como ya fue mencionado, en situaciones de eliminación extremadamente significativa de hepatocitos, o si por alguna razón su crecimiento es inhibido, aparecen las células ovales, producto de la activación del compartimiento de células progenitoras.
A partir de 1999 se agrega una nueva dimensión a esta teoría de las células progenitoras hepáticas, cual es la obtención de células ovales a partir de células progenitoras hematopoyéticas, obtenidas de médula ósea. Las células progenitoras hemopoyéticas migran en el hígado y dan origen a dichas células ovales, hepatocitos y células epiteliares biliares. Petersen y colaboradores24 estudiaron el origen de las células que repoblaron el hígado de animales que recibieron transplante de hígado ortotópico o de médula ósea. La hipótesis planteada fue que las células ovales y otras células hepáticas pueden surgir en la médula ósea, o asociadas a ella. Esta hipótesis fue ensayada a través de tres modelos: 1- transplante de médula ósea en ratas hembras letalmente irradiadas singeneicas, a partir de donantes macho, y detección del cromosoma Y; 2- transplante de médula ósea de donantes positivos para dipeptidil-peptidasa IV, una enzima presente en los espacios canaliculares biliares entre hepatocitos, en animales receptores hembra negativos para esa enzima; 3- transplante de hígado en ratas receptoras que expresan el antígeno L21-6, a partir de donantes alogeneicos que no expresan ese antígeno. En cada modelo, se demostró la posibilidad de que células asociadas a la médula ósea puedan actuar, bajo condiciones fisio-patológicas, como progenitoras de diversos tipos de células hepáticas. Los autores documentaron la aparición de células ovales y de hepatocitos derivados del donante en los animales receptores.
Un trabajo similar fue realizado en ratones25. Los autores realizaron dos tipos de experiencias: 1- ratones hembra, letalmente irradiados, que recibieron transplante de médula ósea completa, a partir de donantes macho, y fueron sacrificados a los días 1, 3, 5 y 7, y 2, 4 y 6 meses pos-transplante; 2- ratones hembra que recibieron transplante de células de médula ósea de donantes macho, pero previamente purificadas, y fueron sacrificadas a los 8 meses. En ambos casos (médula ósea completa y purificada), fueron encontradas células compatibles con hepatocitos, en los hígados de los animales receptores, positivos para cromosoma Y y para mARN de albúmina, a partir del día 7 pos-transplante, en aproximadamente el 2.2% del total de hepatocitos.
En otro trabajo26, se inyectaron intravenosamente, células de médula ósea de ratón adulto, altamente purificadas por técnicas de selección (cell sorter), y transgénicas para el gen lacZ de Escherichia coli, en ratones deficientes en la enzima fumarilacetoacetato-hidrolasa (FAH), un modelo animal de tirosinemia fatal hereditaria tipo I. Tres semanas después del transplante, 4 de 9 animales sobrevivieron, observándose la restauración de la función bioquímica del hígado enfermo. A los 7 meses, esos animales fueron sacrificados, y en los hígados de todos ellos se encontraron nódulos de crecimiento con tinción positiva para beta-galactosidasa, en un 30-50% de la masa total del hígado, demostrándose que esas células provenían de la médula ósea del donante. Los nódulos de crecimiento consistían en pequeñas colonias de alrededor de 50 hepatocitos, o colonias grandes de más de 1x105 células, en ambos casos morfológicamente normales, que expresaban la enzima FAH. Los autores no pudieron demostrar si esas células eran las originalmente injertadas, o su progenie.
Han sido publicados dos estudios hechos en humanos, que confirman los resultados obtenidos en roedores. En uno de ellos27, se obtuvieron especímenes de hígado de dos pacientes femeninas, receptoras de médula ósea de donantes masculinos, y de 4 pacientes masculinos, receptores de transplante ortotópico de hígado, a partir de donantes femeninos, los cuales fueron analizados usando técnicas de hibridización por fluorescencia in situ (FISH) para el cromosoma Y, e inmunohis-toquímica para citoqueratinas 8, 18 y 19. En el caso de las pacientes transplantadas con médula ósea, si bien no tenían historia previa de enfermedad hepática, el examen post-mortem indicó la presencia en sus hígados, de hepatocitos y células ductulares biliares provenientes de los donantes. Esto indicaría que, aún en ausencia de injuria severa, las células podrían movilizarse a un nivel basal, a modo de fenómeno fisiológico. En los pacientes masculinos que recibieron transplante de hígado de donantes femeninos, fueron identificados en el hígado, acúmulos de hepatocitos conteniendo el cromosoma Y, un tiempo después del transplante. Los autores plantean dos explicaciones a estos fenómenos: por un lado, que las células progenitoras hepáticas pasan a través de la circulación y se intercalan en los cordones preexistentes, directamente como hepatocitos, sin un estadío intermedio de células tipo-ovales. Por otro lado, que las células progenitoras extrahepáticas entran como intermediarias tipo-ovales, quizás a través de los canales de Hering. La subsiguiente expansión y diferenciación produciría la formación de los acúmulos de hepatocitos ya mencionados.
La identidad de las células extrahepáticas capaces de desarrollar en células hepáticas no es aún conocida, pero el injerto de células a partir de médula ósea CD34 positiva, sugeriría que las células progenitoras hemato-poyéticas podrían presentar este potencial.
En otro trabajo28, se analizó también la posibilidad de usar células progenitoras hemopoyéticas humanas para generar hepatocitos de reemplazo en un tejido dañado. El daño crónico en el hígado de pacientes tratados con transplante de médula ósea promovería la colonización y amplificación de células progenitoras hemopoyéticas exógenas. Los autores postulan además, que, en casos de daño crónico del hígado, éste podría ser colonizado por células hemopoyéticas tanto endógenas como exógenas.
Estos hallazgos, así como otros referidos a células de médula ósea que derivaron en músculo esquelético o cardíaco29-31, o en células mesenquimáticas32, indicarían que algunas células progenitoras hemopoyéticas podrían ser células itinerantes capaces de sufrir una diferenciación específica de tejido.
El tratamiento de enfermedades hepáticas con células progenitoras hematopoyéticas puede tener considerables ventajas sobre el uso de hepatocitos para ese mismo fin, dado que constituyen una fuente relativamente fácil de células: pueden ser obtenidas de donante vivos, con procedimientos moderadamente invasivos.

Conclusión

El recambio de hepatocitos y células ductulares biliares es prácticamente nulo en el hígado adulto normal. La reparación, después de un daño hepático, es efectuada a través de la proliferación de poblaciones de células diferenciadas de cada tipo. Sin embargo, cierto tipo de daño extremo, puede llevar a la activación de células poco diferenciadas: las células progenitoras, produciéndose su proliferación y acumulación, seguida por la diferenciación en hepatocitos y células ductulares biliares.
Estas observaciones muestran que el hígado, más que un sistema estático de células con funciones metabólicas, es un tejido dinámico, en el cual las células parenquimatosas y sus precursoras, llevan a cabo un amplio y variado, pero a la vez, estrictamente regulado, camino de proliferación y/o diferenciación. El proceso de activación de células progenitoras para generar nuevos hepatocitos y células ductulares biliares tiene capital importancia en dos temas fundamentales de la patofisiología del hígado: el cáncer y la reparación del parénquima hepático masivamente destruido.

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Fig. 1.– Esquema de parte de un acino hepático, donde se muestra la circulación (flechas negras) de la sangre desde la rama de la vena porta y de la arteria hepática, hacia la vena central, a través de los sinusoides
Fig. 3.– Hipótesis de la regeneración hepática a partir de la activación de células progenitoras facultativas localizadas en el canal de Hering. Estas células dan origen a las células ovales, con capacidad clonogénica y bipotencial, que pueden diferenciarse en hepatocitos y células ductales biliares. (Esquema modificado a partir del diagrama de Stem Cells, por CS Potten (ed), 1997).

Fig. 2.– Esquema del origen y diferenciación de hepatocitos y células ductales biliares, a partir de células endodérmicas multipotenciales que migran en el septo transverso, dando origen a hepatoblastos bipotenciales. Se menciona también el origen de células incompletamente diferenciadas, con capacidad progenitora bipotencial, que se incluyen en el canal de Hering. (Esquema modificado a partir del diagrama de Stem Cells, por CS Potten (ed), 1997).