ANTIINFLAMATORIOS NO ESTEROIDEOS Y FUNCION PLAQUETARIA
ACCION DEL CLONIXINATO DE LISINA SOBRE LA FUNCION PLAQUETARIA
COMPARACION CON OTRAS DROGAS ANTIINFLAMATORIAS NO ESTEROIDEAS
Estela
H. Kramer1, Beatriz Sassetti2, Alfredo J. Kaminker1, Antonio R. de los
Santos3, Manuel L. Martí3, Guillermo Di Girolamo4
1División Hematología,
Hospital de Clínicas José de San Martín, Facultad de Medicina,
2Departamento de Química Biológica, Facultad de Ciencias Exactas y
Naturales, 3Departamento de Medicina, Hospital de Clínicas José de
San Martín, Facultad de Medicina, 4Departamento de Farmacología,
Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires.
Resumen
El grupo
de los antiinflamatorios no esteroideos (AINEs) posee como uno de sus
mecanismos de acción la inhibición de la síntesis de
prostaglandinas. Este efecto explica muchas de las acciones
farmacológicas y de los eventos adversos observados en el uso
clínico. La administración de AINEs a pacientes con trastornos de la
hemostasia o en estados perioperatorios incrementan el riesgo de
hemorragias por inhibición de las funciones plaquetarias. En este
trabajo se estudian las modificaciones plaquetarias inducidas por el
clonixinato de lisina comparadas con las del diclofenac, ibuprofeno y
aspirina, mediante pruebas clásicas (recuento de plaquetas,
producción de factor 3 plaquetario, agregación con diversos
inductores) y procedimientos más recientes (medición de P-selectina
por citometría de flujo). El clonixinato de lisina no produjo
modificaciones en el número ni en la función plaquetaria cuando fue
administrado a voluntarios sanos en las dosis terapéuticas usuales,
cosa que sí ocurrió con las drogas control.
Palabras clave: antiinflamatorios, clonixinato
de lisina, función plaquetaria, P-selectina, hemostasia
perioperatoria
Abstract
Effects
of lysine clonixinate on platelet function. Comparison with other
non-steroid anti-inflammatory drugs. One of the mechanisms of
action of non steroid antiinflammatory drugs (NSAIDs) consists of
inhibition of prostaglandin synthesis. This explains many of the
pharmacological effects and adverse events observed in medical
practice. Administration of NSAIDs to patients with hemostatic
disorders or perioperative conditions entails the risk of bleeding due
to inhibition of platelet function. This study deals with platelet
changes induced by lysine clonixinate vs diclofenac, ibuprofen and
aspirin in classical tests such as platelet count, platelet factor 3
(PF3) activity and platelet aggregation with various inductors and
more recent procedures such as P-selectin measurement by flow
cytometry. Unlike control drugs, lysine clonixinate did not induce
changes in platelet count or function when administered to healthy
volunteers at the commonly used therapeutic doses.
Key words: antiinflammatory agents, lysine
clonixinate, platelet function, P-selectin
Dirección postal: Dr. Alfredo Kaminker, Paraguay
2302, 1121 Buenos Aires, Argentina.
FAX: (54-11) 4961-7778 e.mail: euroway@sinectis.com.ar
Recibido: 22-IV-1999 Aceptado: 27-II-2001
Los analgésicos antiinflamatorios no esteroideos (AINEs) tienen
numerosas indicaciones en la práctica clínica habitual. Además de
controlar el dolor presentan otras propiedades farmacológicas que
pueden configurar ventajas o inconvenientes según el fin buscado y la
magnitud de la respuesta alcanzada.
Un claro ejemplo es el efecto inhibitorio sobre la función
plaquetaria cuyo empleo en la prevención y tratamiento de los
accidentes de placa ha modificado la evolución y el pronóstico de la
enfermedad ateroescle-rótica1,2; por el contrario esta propiedad
puede ser riesgosa en enfermedades congénitas o adquiridas de la
coagulación, en los trastornos cualitativos o cuantitativos de las
plaquetas, en los pacientes sometidos a tratamiento con heparina, con
anticoagulación crónica o antiagregación plaquetaria intensa3 o en
los estados perioperatorios. Precisamente en estos casos sería
conveniente contar con un fármaco que no altere la hemostasia.
Los AINEs como grupo interfieren la función plaque-taria inhibiendo
la agregación en grados diversos.
Los nuevos conocimientos sobre la farmacodinamia de los AINEs orientan
a la búsqueda de fármacos con acción selectiva sobre la
ciclooxigenasa 2 o inducida por mecanismos histolesivos, sin
modificación de la ciclooxigenasa 1 o constitutiva, de la cual
dependen funciones fisiológicas que es conveniente respetar.
Dado que las plaquetas sólo poseen ciclooxigenasa 1, presuntamente
poco influida por el clonixinato de lisina4,6 se ha llevado a cabo el
presente estudio para evaluar su actividad inhibitoria sobre las
plaquetas, y compararla con la de otros AINEs como el ácido acetil
salicílico (AAS), ibuprofeno y diclofenac.
Materiales y métodos
Pacientes:
El protocolo de investigación fue aprobado por el Comité de Etica
del Hospital de Clínicas. Los participantes en el estudio dieron su
conformidad por escrito, previa información sobre el desarrollo del
mismo. Los voluntarios fueron controlados clínicamente a lo largo de
todo el estudio.
Se estudiaron 18 voluntarios sanos, de sexo masculino y de edades
entre 21 y 38 años.
La condición de sanos fue establecida por historia clínica, examen
físico y estudios de laboratorio que comprendieron: hemograma,
eritrosedimentación, urea, glucemia, uricemia, hepatograma,
gamaglutamil transpeptidasa, proteinograma electroforético, tiempo de
Quick, KPTT, recuento de plaquetas, tiempo de sangría, tiempo de
coagulación, pruebas para hepatitis B y C, pruebas para HIV,
ionograma sérico y examen físico - químico y sedimento de orina.
Se excluyeron los voluntarios con enfermedades crónicas, antecedentes
de operaciones quirúrgicas dentro de los 2 meses previos,
transfusiones, deportistas competitivos y fumadores.
Drogas en estudio
El clonixinato de lisina (sal de L-lisina del ácido
2-[(3-cloro-2-metilfenil)-amino]-3-piridinocarboxilato) es un
analgésico antiinflamatorio no esteroide derivado del ácido
antranílico cuyo mecanismo de acción fundamental sería la
inhibición de la ciclooxigenasa 24,5, lipooxigenasa y óxido nítrico
sintasa.
La administración de 1 comprimido de 125 mg cada 6 horas durante 4
días mostró (Cmáx 5.6 ± 2.1 µg.h/ml, ABC 7.8 ± 2.2 µg.h/ml) que
se conservan las características cinéticas de la administración de
una dosis única (Cmáx 5.8 ± 2.4 µg.h/ml, ABC 7.3 ± 2.3 µg.h/ml).
Se administraron 4 diferentes AINEs por vía oral a dosis
terapéuticas. Un lapso de lavado de 7 a 10 días medió entre cada
ciclo terapéutico. La secuencia de los mismos se realizó en forma
aleatoria. Se eligió como último fármaco para todos los voluntarios
al AAS. Esta decisión se tomó ya que debido al efecto más
prolongado de la mencionada droga, el tiempo de lavado excedía los 15
días, lo que prolongaría en exceso la duración del estudio y el
tiempo requerido a los voluntarios.
El plan de tratamiento para cada fármaco fue:
1. Clonixinato de lisina: 125 mg, 1 comprimido tres veces por día
durante tres días y un comprimido una hora antes del estudio.
2. Ibuprofeno: 400 mg, 1 comprimido tres veces por día durante tres
días y un comprimido una hora antes del estudio.
3. Diclofenac: 50 mg, 1 comprimido dos veces por día y un comprimido
una hora antes del estudio.
4. Acido acetil salicílico (AAS): 500 mg, 1 comprimido una vez por
día durante tres días y un comprimido una hora antes del estudio.
La última dosis previa a la toma de la muestra de sangre fue
administrada en el laboratorio para asegurar el cumplimiento de la
indicación.
Muestras de sangre
Las muestras de sangre se extrajeron por punción venosa, con
mínimo trauma.
Se recolectó la sangre en tubos plásticos conteniendo EDTA
tripotásico al 15% p/v para los recuentos celulares y en tubos
conteniendo citrato de sodio 3.13% para los estudios de agregación
plaquetaria, citometría de flujo y expresión de PF3. Las muestras
previas y posteriores a la administración de cada AINE se procesaron
dentro de las 2-3 horas de obtenidas.
Recuento de plaquetas
Los recuentos plaquetarios se realizaron en forma manual y
automatizada y control con extendidos de sangre periférica. Valor
normal para adultos: 150 – 400 x 109 / L.
Agregación plaquetaria
Se evaluó en plasma rico en plaquetas (PRP) empleando el método
óptico de Born7. Se utilizó un agregómetro óptico de dos canales
(Chrono-Log, modelo 490) con un registrador de dos plumas (Chrono-Log
modelo 707) y con un software (Aggro-Link)
La sangre citratada fue centrifugada a 100 g durante 20 minutos para
la obtención de PRP. Luego el resto de la muestra se centrifugó a
2000 r.p.m., para obtener plasma pobre en plaquetas (PPP). Se ajustó
el número de plaquetas de los PRP con los PPP autólogos a 300 x 10 9
/ L.
Como agregantes se utilizaron los siguientes agonistas: a) ADP (Sigma)
8 µM, 4 µM, 2 µM y 1 µM; b) AA (ácido araquidónico) (Sigma) 1.2
mM; c) Colágeno de tendón (Medi-Tech) 2 µg/ml.
Se evaluaron cambios de forma, período de latencia y amplitud máxima
de cada curva de agregación (Expresada en % de la escala de
graficación).
El porcentaje de inhibición de los AINEs sobre la agregación
plaquetaria se calculó midiendo la amplitud máxima de la curva de
agregación en el estado basal y se la comparó con la obtenida
post-tratamiento.
Determinación de factor 3 plaquetario (PF3)
Se midió la disponibilidad de PF3 en PRP ajustado a 200 x 109 / L
plaquetas, según la técnica de Hardisty RM et al.8. El rango normal
se calculó con el PRP obtenido de 62 controles sanos tomados al azar
de los donantes de un banco de sangre. (X- ± DS= 33 ± 4 segundos).
Determinación de la expresión de CD 62P.
Se midió la expresión de P-selectina plaquetaria en PRP de los 18
voluntarios en estado basal y post-tratamiento con cada uno de los
AINEs. Se estimuló con colágeno de tendón 2 µg/ml. Las plaquetas
en reposo y post-estimulación con colágeno se marcaron utilizando un
método directo con el anticuerpo monoclonal CD 62P-FITC (Immunotech
International). Se fijaron con paraformaldehido 2% en PBS y se
conservaron a 4°C hasta el momento de la lectura (período £ una
semana).
Control negativo: Anti-IgG1-ratón-FITC (Immunotech International).
Se cuantificó con citómetro de flujo ORTHO Cytotron Absolute
(argón-laser) de 15 nW de potencia. Se analizaron los resultados con
el software WinMDI 2.59-11. Las plaquetas marcadas se observaron
también por microscopía de fluorescencia. Se compararon los
resultados basales con los obtenidos post-tratamiento calculándose el
porcentaje de inhibición de la activación plaquetaria12-15. El
estudio de agregación plaquetaria por el método óptico de Born, la
expresión de P-selectina por citometría de flujo como CD 62P, la
expresión de PF3 y los recuentos plaquetarios, fueron realizados en
los 18 voluntarios en forma basal (como uno de los criterios de
inclusión en el protocolo de trabajo) y después de haber sido
medicados con los distintos antiinflamatorios (según el esquema
terapéutico mencionado anteriormente).
Estadística
Los resultados fueron analizados mediante un ANOVA no paramétrico
de Friedman y posterior test de Dunn, ya que no se pudo demostrar la
normalidad de los datos grupales. La significación fue considerada
cuando la probabilidad (p) fue menor de 0.05.
Resultados
Recuento de plaquetas y disponibilidad de PF3
No se observaron modificaciones entre los recuentos de plaquetas ni
en las determinaciones de PF3 basales y las posteriores a la
administración de AINEs (Tabla 1).
Efecto inhibitorio de los AINEs sobre la agregación plaquetaria
El AAS mostró un efecto inhibitorio altamente significativo con
todos los agonistas utilizados, en especial con el ADP y el ácido
araquidónico. Las curvas de agregación plaquetaria de los 18
voluntarios sanos fueron reversibles; aún a concentraciones elevadas
de ADP (8 µM) todos los trazados carecieron de segunda ola de
agregación.
Respuestas similares pero con menor intensidad se hallaron con
ibuprofeno y diclofenac (Fig. 1, 2 y 3). El clonixinato de lisina no
produjo efecto inhibitorio con ninguno de los agentes agregantes al
nivel de significación p<0.05 (Tabla 2).
Expresión de P-Selectina plaquetaria. Análisis por citometría de
flujo (Figuras 4 a 9)
En los histogramas se representa sobre el eje de las abscisas la
intensidad de fluorescencia y sobre el de las ordenadas, el recuento
de plaquetas.
La Fig. 4 compara el área debajo de los histogramas correspondientes
a: a) Expresión de CD 62P en plaquetas estimuladas y b) Control
negativo, indicador de la marcación inespecífica de las plaquetas.
Nótese la coincidencia entre a) y b) en cada una de las experiencias;
esto nos muestra que ninguno de los voluntarios participantes
presentó activación de sus plaquetas en estado basal (criterio de
inclusión en el protocolo de estudio realizado). También nos sirve
como control de calidad del método empleado, ya que ni en la
extracción de sangre, ni en la obtención del plasma rico en
plaquetas se produjo activación plaquetaria con la consiguiente
expresión en la membrana celular de la GMP-140 (PADGEM P-Selectina),
identificados como CD 62P.
Las Fig. 5, 6, 7, 8, 9 comparan el área debajo de los histogramas
correspondientes a: b) Control negativo c) Expresión de CD 62P en
plaquetas estimuladas con colágeno.
El área debajo del trazado c) de la Fig. 5 representa la expresión
de CD 62P en las plaquetas estimuladas con colágeno, previo a recibir
alguno de los diferentes AINEs (basal), en la Fig. 6, después de
clonixinato de lisina, en la 7 posterior a diclofenac sódico, en la 8
post ibuprofeno y en la 9 post AAS. Nótese que el área debajo del
trazado c) y el de b) es mayor en la Fig. 5 y disminuye en los
siguientes indicando una reducción de la expresión de CD 62P
plaquetario. Cuanto menor es el área mayor es el efecto inhibitorio
del AINE. No existieron diferencias significativas entre los valores
basales y los obtenidos post - administración de clonixinato de
li-sina.
Discusión
La utilización de analgésicos con efecto inhibitorio plaquetario
como los AINEs convencionales en tratamientos anticoagulantes, en
pacientes con defectos hemostáticos o incluso en aquellos que
requerirían un sistema hemostático indemne, como los recientemente
operados, constituye un problema aún no resuelto. Usualmente se
recurre a drogas antitérmicas pero con débil actividad analgésica o
a otras de mayor eficacia analgésica pero serios efectos colaterales,
como los opiáceos.
Los efectos inhibitorios de los diferentes AINEs pueden verse con
claridad tanto en las curvas de agregación plaquetaria como en la
expresión de CD 62P en la membrana plaquetaria post estimulación con
colágeno (Tabla 3). En aquellos casos en los que se evidenció
inhibición de la agregación también se observó disminución de la
expresión de CD 62P. Existió una buena correlación entre ambos
métodos de evaluación de la función plaquetaria (Tabla 3). Los
voluntarios 5,10 y 11 mostraron un ligero efecto inhibitorio con
clonixinato de lisina. Los voluntarios 6, 8 y 10 no lo presentaron con
diclofenac.
El clonixinato de lisina no produjo modificación de la función
plaquetaria en las dosis terapéuticas utilizadas y en las condiciones
del estudio realizado. Así mismo se halló una diferencia
significativa en el efecto producido entre el clonixinato de lisina y
los otros AINEs. Esta diferencia fue muy notable con el ácido
araquidónico como agente agregante.
No se encontraron diferencias en la evaluación comparativa de los
otros AINEs entre sí.
Si bien la utilización de esta droga en situaciones en las que es
preferente evitar la alteración de la hemostasia, está ya
relativamente difundida en algunos países de Latinoamérica y
España, no existían datos actualizados que avalaran dicha estrategia
como los obtenidos en el presente estudio.
En el mismo se comparan los efectos sobre distintos parámetros de la
función plaquetaria, del clonixinato de lisina, respecto de otros
fármacos de potencia analgésica parecida y efectos colaterales
comparables utilizados en situaciones similares.
Para ello se emplearon técnicas que miden diferentes funciones
plaquetarias y que en reportes anteriores no habían sido
comparadas16,17 tales como el ya tradicional método óptico
turbidimétrico de Born7, y la medición de la P-selectina plaquetaria
por citometría de flujo9-11, más recientemente incorporada en la
práctica clínica como en experimentación.
Por lo tanto el clonixinato de lisina dentro del grupo de los AINEs,
puede ser de utilidad clínica en aquellos pacientes en los cuales es
necesario evitar el efecto antihemostático y el sangrado.
Agradecimientos: Los autores agradecen la excelente
asistencia técnica para la realización del presente trabajo de la
Sra. Gabriela Naón. (Técnica hematóloga División Hematología,
Hospital de Clínicas José de San Martín, Facultad de Medicina,
Universidad de Buenos Aires)
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Tabla 3 .- Efecto inhibitorio de los AINEs en la agregación
plaquetaria y en la expresión de CD 62P en la membrana plaquetaria
(Expresado en porcentajes de inhibición)
clonixinato de lisina diclofenac ibuprofeno AAS
Col AA ADP CD62P Col AA ADP CD62P Col AA ADP CD62P Col AA ADP CD62P
N 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18
Mediana 0 0 3.5 2 59.5 100 47 52.5 69 100 55.5 56 65 100 65 61.5
Rango 0-19 0-23 0-22 0-25 0-100 0-100 0-67 0-95 44-100 69-100 41-65
49-73 50-100 87-100 50-86 46-71
ADP = Adenosin difosfato; AA = Acido araquidónico; COL = Colágeno
de tendón; AAS = Acido acetil salicílico
Tabla 1.- Recuento de plaquetas y disponibilidad de PF3
Recuento de Plaquetas (valores x 109 / L)
Basal Post Post Post Post
Clonixinato de Diclofenac Ibuprofeno AAS
lisina
Media 220 225 229 232 230
DS 30 40 38 34 38
N 18 18 18 18 18
Normal: 150 – 400 x 109/L
Disponibilidad de PF3 en segundos
Basal Post Post Post Post
Clonixinato Diclofenac Ibuprofeno AAS
de lisina
33 ± 3 34 ± 3 34 ± 2 34 ± 3 35 ± 3
VN: 33 ± 4 segundos
VN = Valor Normal; PF3 = Factor 3 plaquetario
Tabla 2.- Comparación de los efectos inhibitorios sobre la
agregación plaquetaria y en la expresión de CD 62P, inducidos por
los diferentes AINEs (Significaciones estadísticas).
Clonixinato de lisina Diclofenac Ibuprofeno
Agregación Agregación Agregación
Plaquetaria CD 62P Plaquetaria CD 62P Plaquetaria CD 62P ADP AA COL
ADP AA COL ADP AA COL
Diclofenac NS <0.001 <0.05 <0.05 —- —- —- —- —-
—- —- —-
Ibuprofeno <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 NS NS NS NS —-
—- —- —-
AAS <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 NS NS NS NS NS
NS NS
P £ 0.05
ADP = Adenosin difosfato; AA = Acido araquidónico; COL = Colágeno de
tendón; NS = No significativo
Fig. 4.- HISTOGRAMAS. a- Expresión CD 62p en plaquetas no
estimuladas; b- Control negativo
Fig. 1.- Agregación inducida por ADP 4 µM. A) basal; B) post
clonixinato de lisina, C) post diclofenac sódico, D) post ibuprofeno,
E) post AAS. ADP = Adenosin difosfato
Fig. 2.- Agregación inducida por colágeno 2 µg/ml. A) basal, B)
post clonixinato de lisina, C) post diclofenac sódico, D) post
ibuprofeno, E) post AAS
Fig. 3.- AA 1,2 mM. A) basal, B) post clonixinato de lisina, C)
post diclofenac sódico, D) post ibuprofeno, E) post AAS
Fig. 5.- HISTOGRAMAS. b- Control negativo; c- Expresión CD 62p
plaquetas estimuladas con colágeno
Fig. 6.- HISTOGRAMAS. b- Control negativo; c- Expresión CD 62p
plaquetas estimuladas con colágeno
Fig. 7.- HISTOGRAMAS. b- Control negativo; c- Expresión CD 62p
plaquetas estimuladas con colágeno
Fig. 8.- HISTOGRAMAS. b- Control negativo; c- Expresión CD 62p
plaquetas estimuladas con colágeno
Fig. 9.- HISTOGRAMAS. b- Control negativo; c- Expresión CD 62p
plaquetas estimuladas con colágeno
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