STREPTOCOCCUS PYOGENES VS PENICILINA Y ERITROMICINA

STREPTOCOCCUS PYOGENES: SENSIBILIDAD A PENICILINA Y ERITROMICINA EN LAS CIUDADES DE NEUQUEN Y CIPOLLETTI

SILVIA V. SORIANO1, SUSANA BRASILI2, MONICA SAIZ3, CRISTINA CARRANZA4, PATRICIA VIDAL5, JORGE CALDERON1, HORACIO A. LOPARDO5

1 Sección de Bacteriología y Servicio de Infectología, Policlínico Neuquén; 2 Sección de Bacteriología, Hospital Bouquet Roldán, Neuquén; 3 Sección de Bacteriología, Policlínico Modelo, Cipolletti, Río Negro; 4 Sección de Bacteriología, Hospital Pedro Moguillansky, Cipolletti, Río Negro; 5 Laboratorio de Microbiología, Hospital de Pediatría Juan P. Garrahan, Buenos Aires

Key words: Streptococcus pyogenes, erythromycin, penicillin

Resumen

Hasta la fecha no se ha detectado resistencia a penicilina en Streptococcus pyogenes. No obstante se ha registrado un aumento en la resistencia a macrólidos en varios países del mundo. En la Argentina se han observado escasos porcentajes de resistencia a eritromicina, a excepción de un 11.1% registrado en Mendoza. El objetivo del presente trabajo fue estudiar la sensibilidad in vitro a penicilina y eritromicina de 251 aislamientos sucesivos de S. pyogenes obtenidos en cuatro centros asistenciales localizados en las ciudades de Neuquén y Cipolletti durante el período abril-diciembre de 1998. Se empleó el método de difusión con discos de penicilina y el método del doble disco (eritromicina 15 µg y clindamicina 2 µg) para observar la resistencia a macrólidos y el mecanismo involucrado. Los aislamientos resistentes a macrólidos fueron estudiados por E-test (AB Biodisk, Solna, Suecia) para establecer los niveles de sensibilidad a eritromicina, y por dilución en agar para penicilina, eritromicina, ceftriaxona, azitromicina y clindamicina. Todos los aislamientos fueron sensibles a penicilina y treinta de ellos (12.0%) fueron resistentes a eritromicina. Estos ?timos mostraron el fenotipo M, caracter?tico del mecanismo de eflujo activo. Todos los aislamientos resistentes a eritromicina (CIM entre 8 y 16 mg/l) tambi? resultaron resistentes a azitromicina, pero sensibles a clindamicina, penicilina y ceftriaxona. De acuerdo a estos resultados concluimos que S. pyogenes continúa siendo sensible a la penicilina, pero creemos que en nuestra zona es necesario realizar estudios rutinarios de pruebas de sensibilidad a macrólidos debido al relativamente elevado porcentaje de resistencia a eritromicina observado.

Abstract

Streptococcus pyogenes: penicillin and erythromycin susceptibility in the cities of Neuquen and Cipolletti. Penicillin resistance has not yet been detected in Streptococcus pyogenes. However macrolide-resistant streptococci have emerged in several countries. Only low rates of erythromycin-resistant S. pyogenes were reported in Argentina, with the exception of a 11.1% observed in Mendoza. The aim of the present study was to determine the susceptibility to penicillin and to erythromycin of 251 consecutive clinically-significant isolates of S. pyogenes obtained from four centers of Cipolletti and Neuquén during the period April-December 1998. The double disk test with erythromycin and clindamycin disks was employed as a screening method to detect ERY-resistant streptococci and to determine the phenotype of macrolide resistance. Disk diffusion was also employed for determining penicillin susceptibility. Macrolide-resistant isolates were also tested for penicillin, ceftriaxone, erythromycin, clindamycin and azithromycin susceptibility by the agar dilution method. Additionally they were also tested for erythromycin susceptibility by E-test (AB Biodisk, Solna, Sweden). All streptococci studied were susceptible to penicillin and thirty of them (12.0%) were resistant to erythromycin. All these resistant isolates were also resistant to azithromycin but susceptible to ceftriaxone and clindamycin. They showed the phenotype M (probably efflux-mediated mechanism) and the MICs of erythromycin ranged between 8 and 16 µg/ml. According to these results we conclude that in spite of universal susceptibility to penicillin in S. pyogenes, macrolide resistance is a matter of concern in Neuquén and Cipolletti. At least in those cities it appears to be necessary to routinely perform macrolide susceptibility tests in beta-hemolytic streptococci.

Dirección postal: Dr. Horacio A. Lopardo, Laboratorio de Microbiología, Hospital de Pediatría Juan P. Garrahan, Combate de los Pozos 1881, 1245 Buenos Aires, Argentina
Fax: (54-11) 4308-5325 e-mail: hlopardo@garra.giga.com.ar

Recibido: 17-IV-2000 Aceptado: 8-VI-2000

El Streptococcus pyogenes se ha mantenido sensible a bajas concentraciones de penicilina a través del tiempo1. Este antibiótico continúa siendo el de primera elección para el tratamiento de muchas de las infecciones producidas por este microorganismo. Eritromicina, clindamicina, y los nuevos macrólidos (roxitromicina, claritromicina, azitromicina, etc.) son drogas alternativas especialmente indicadas en casos de hipersensibilidad a penicilina. El uso de los nuevos macrólidos para el tratamiento de las faringitis estreptocócicas es cada vez más frecuente debido a su cómoda administración y buena tolerancia gástrica.
A diferencia de la uniforme sensibilidad a penicilina, se ha descripto el aumento de la resistencia a macr?idos en varios pa?es del mundo: Reino Unido2, Australia3, Japón4, Finlandia5, Italia6, España7, Taiwan8.
En la Argentina, los estudios publicados hasta el momento coincidieron en señalar la sensibilidad a penicilina de las cepas estudiadas e informaron porcentajes muy bajos de resistencia a eritromicina y macrólidos. En 1987, Casellas y col. no detectaron ninguna cepa resistente a eritromicina sobre 30 aislados de S. pyogenes estudiados9. En otro estudio, realizado entre 1989 y 1994 con 373 cepas, se detectó un 0.5% de resistencia a eritromicina considerando todo el período. Las cepas resistentes fueron aisladas solamente durante 1989 elevando la incidencia para ese año al 1.5%. En 1994 se realizó un estudio multicéntrico que incluyó 1767 cepas de S. pyogenes aisladas en 58 centros de todo el país durante los meses de mayo y octubre. La resistencia global a eritromicina resultó del 0.14% en mayo y del 0.28% en octubre11. Sin embargo, se observaron diferencias regionales ya que las cepas aisladas en algunos lugares tuvieron una resistencia mayor (Concordia: 6.2-7.7%, Mendoza: 0-1.6%). En un estudio adicional realizado en Mendoza en 1995 la resistencia a eritromicina fue del 11.1%11.
Teniendo en cuenta estas diferencias regionales, decidimos realizar el presente trabajo para evaluar la sensibilidad a penicilina y eritromicina en nuestra zona. En el mismo intervinieron cuatro centros asistenciales: Policlínico Neuquén y Hospital Bouquet Roldán de la ciudad de Neuquén y Policlínico Modelo y Hospital Pedro Moguillansky de la ciudad de Cipolletti. Estas dos ciudades, si bien pertenecen a diferentes provincias argentinas, se encuentran geográficamente muy próximas e integradas en una misma región.
Se estudiaron 251 aislamientos sucesivos de S. pyogenes obtenidos a partir de materiales clínicos de pacientes atendidos en los cuatro centros participantes durante el período abril-diciembre de 1998.
Del total de cepas estudiadas, 69 (27.5%), fueron recuperadas de pacientes adultos y 182 (72.5%) de pacientes pediátricos. Doscientas treinta y dos cepas (92.4%) fueron aisladas de exudados de fauces y 19 (7.6%) de otros materiales (heridas: 9; oído medio: 3; sangre: 3; flujo vaginal: 2; esputo: 1; senos paranasales: 1).
La identificación de los microorganismos aislados se realizó mediante las siguientes pruebas: sensibilidad a 0.04 UI de bacitracina con discos comerciales (Britania, Buenos Aires, Argentina) e hidrólisis de PYR (L-pirro-lidonil-B-naftilamida) en discos (PYR-A-ENT, Britania, Buenos Aires). Como pruebas confirmatorias se emplearon la de Voges-Proskauer y la aglutinación con antisuero específico con partículas de látex (Slidex Strepto-Kit BioMérieux, Marcy l’Étoile, Francia).
Para estudiar su sensibilidad a los antibióticos se empleó el método de difusión en medio sólido según normas NCCLS12. Los in?ulos se realizaron a partir de estr?s en medio s?ido de 24 horas de incubaci?, resuspendiendo colonias aisladas en caldo Mueller-Hinton. La concentraci? bacteriana se ajust·de modo de obtener una turbiedad equivalente a la del tubo N? 0.5 de la escala de Mc Farland.
Se utilizó agar Mueller-Hinton (Britania, Buenos Aires), adicionado con sangre ovina al 5% (Alfredo Gutiérrez S.R.L., Buenos Aires, Argentina). Se emplearon discos comerciales de 10 UI de penicilina y 15 µg de eritromicina. (Britania). Las placas se incubaron 18 horas a 35° C.
Como cepa de referencia para el control del método de difusión se utilizó Staphylococcus aureus ATCC 25923.
Para la identificación de los mecanismos de resistencia a macrólidos se utilizaron discos comerciales de 15 µg de eritromicina y 2 µg de clindamicina colocados a 2.5 cm de distancia entre sí (método del doble disco). Este método se realizó en las mismas condiciones que las descriptas anteriormente para las pruebas de difusión. Adicionalmente se realizaron pruebas de E-test para eritromicina de acuerdo a las indicaciones del fabricante (AB Biodisk, Solna, Suecia). Además, se emplearon discos de lincomicina (10 µg), espiramicina (100 µg), pristi-namicina I (estreptogramina B) (40 µg) y pristinamicina II (estreptogramina A) (20 µg) tal como se describiera previamente11.
Se utilizó también el método de dilución en medio sólido con placas de Agar Mueller Hinton adicionadas de 5% de sangre ovina y de las diluciones de los antibióticos: penicilina (0.007-8.0 mg/l), ceftriaxona (0.007-8.0 mg/l), eritromicina (0.06-128 mg/l), clinda-micina (0.06-128 mg/l) azitromicina (0.06-128 mg/l). Los inóculos bacterianos fueron de 104 UFC/gota, utilizándose un replicador de Steers para su distribución en las placas. La incubación se realizó en atmósfera normal a 35 °C durante 24 horas.
Las 251 cepas estudiadas resultaron ser sensibles a penicilina, exhibiendo halos de inhibición entre 28 y 40 mm. Todas ellas fueron identificadas como S. pyogenes por producir aglutinación con el reactivo de látex correspondiente y por dar positivas las pruebas de PYR y bacitracina (sensible) y negativa la de Voges-Proskauer.
Treinta cepas (12.0%) fueron resistentes a eritro- micina con halos de inhibición entre 9 y 17 mm y 221 (88.0%) resultaron sensibles, con halos mayores de 21 mm.
Todas las cepas resistentes a eritromicina fueron sensibles a clindamicina, lincomicina, pristinamicinas y espiramicina cuando fueron ensayadas por el método de difusión. Ninguna de ellas presentó antagonismo eritromicina-clindamicina por el método de aproximación de discos (Tabla 1).
Tanto las pruebas de E-test como las de dilución en medio sólido mostraron datos de CIM para eritromicina entre 8 y 16 mg/l (Tabla 1).
En los ensayos de dilución, coincidentemente, las cepas resistentes a eritromicina resultaron ser sensibles a penicilina (CIM < 0.03 mg/l) a ceftriaxona (CIM < 0.015 mg/l) y a clindamicina (CIM < 0.06 mg/l). Las CIM de azitromicina oscilaron entre 32 y 64 mg/l (Tabla 1).
De acuerdo a los resultados obtenidos en nuestro trabajo podemos decir que S. pyogenes contin? siendo altamente sensible a penicilina en nuestra zona. Sin embargo, la resistencia a eritromicina fue del 12.0%. Este valor difiere de los datos publicados hasta el momento en Argentina, donde la resistencia a este antibi?ico habitualmente no superaba el 1.5%6, 7, 8, pero se asemeja al 11.1% de resistencia observada en Mendoza en 199511.
El nivel de resistencia a eritromicina encontrado en nuestro estudio nos plantea la necesidad de mantener una vigilancia epidemiológica activa de la misma y nos alerta sobre el riesgo del uso empírico de macrólidos en faringitis estreptocócicas. Creemos necesario en nuestra zona la realización rutinaria de pruebas de sensibilidad a macrólidos ante el aislamiento de S. pyogenes de materiales clínicos.
Teniendo en cuenta que las cepas resistentes a eritromicina fueron sensibles a clindamicina sin deformación de los halos de inhibición, los fenotipos encontrados parecen coincidir con un mecanismo de resistencia mediado por eflujo activo, ya descripto anteriormente en cepas argentinas11. La posibilidad de utilización de clindamicina frente a esas cepas motiva la necesidad del reconocimiento del posible mecanismo involucrado debido a las ventajas que parece aportar este antibiótico respecto de la penicilina en el tratamiento de infecciones estreptocócicas severas14.

Agradecimientos: A Alejandra Mastroianni por su excelente colaboración técnica. A Alfredo Gutiérrez S.A. por el aporte de sangre desfibrinada de oveja. A los Dres. Carlos Guardiano y Ronaldo Meda de Laboratorios Britania SRL por su constante apoyo técnico y por el aporte de discos de identificación y de antibiograma

Bibliografía

1. O’Brien TF. Global surveillance of antibiotic resistance. N Engl J Med 1992; 326: 339-40.
2. Phillips G, Parratt D, Orange GV, Harper I, McEwan H, Young N. Erythromycin-resistant Streptococcus pyogenes. J Antimicrob Chemother 1990; 25: 723-4.
3. Stingemore M, Francis GRJ, Toohey M, McGechie DB. The emergence of erythromycin resistance in Strepto-coccus pyogenes in Fremantle, Western Australia. Med J Aust 1989; 150: 626-31.
4. Maruyama S, Yoshioka H, Fujita K, Takimoto M, Satake Y. Sensitivity of group A streptococci to antibiotics. Am J Dis Child 1979; 133: 1143-5.
5. Seppala H, Nissinen A, Yu Q, Huovinen P. Three different phenotypes of erythromycin-resistant Streptococcus pyogenes in Finland. J Antimicrob Chemother 1993; 32: 885-91.
6. Cornaglia G, Ligozzi M, Mazzariol A, Valentini M, Orefici G. The Italian Surveillance Group for Antimicrobial Resistance, Fontana R. Rapid increase of resistance to erythromycin and clindamycin in Streptococcus pyogenes in Italy 1993-1995. Emerg Infect Dis 1996, 2: 339-42.
7. P?ez Trallero E, Urbieta M, Montes M, Ayestar? I, Marim? JM. Emergence of Streptococcus pyogenes strains resistant to erythromycin in Gipuzkoa, Spain. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1998; 16: 25-31.
8. Hsueh P, Chen H, Huang A, Wu J. Decreased activity of erythromycin against Streptococcus pyogenes in Taiwan. Antimicrob Agents Chemother 1995; 39: 2239-42.
9. Casellas JM, Goldberg M, D’Andrea E, Arduino S, Godin M. Actividad in vitro de roxitromicina y otros antimicro-bianos frente a bacterias aisladas de pacientes pediátricos. Arch Arg Pediatr 1987; 85: 233-8.
10. Lopardo H, Venuta ME, Vidal P, Fernández N, Conci AM, Rubeglio EA. Streptococcus pyogenes: Vigilancia de su resistencia a los antibióticos en un hospital pediátrico. Infect Microbiol Clin 1995; 7: 53-6.
11. Lopardo H, Venuta ME, Vidal P, et al. The Argentinian Streptococcus Study Group (100 participants). Argentinian collaborative study on prevalence of erythromycin and penicillin susceptibility in Streptococcus pyogenes. Diagn Microbiol Infect Dis 1997; 28: 29-32.
12. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests. Approved standard M2-A5. Villanova, PA. National Committee for Clinical Laboratory Standards 1995.
13. Leclercq R, Courvalin P. Intrinsic and unusual resistance to macrolide, lincosamide, and streptogramin antibiotics in bacteria. Antimicrob Agents Chemother 1991; 35: 1273-6.
14. Stevens DL. Streptococcal toxic-shock syndrome: spectrum of disease, pathogenesis, and new concepts in treatment. Emerg Infect Dis 1995; 1: 69-78.

TABLA 1.– Resultados de las pruebas de sensibilidad a los antibióticos con 30 aislamientos de Streptococcus pyogenes resistentes a eritromicina obtenidos en las ciudades de Neuquén y Cipolletti, Argentina, año 1998

Antibiótico Método empleado
Difusión con discos Dilución en agar E-test
Carga Halo Categoría1 CIM Categoría CIM Categoría
(mm) (mg/l (mg/l)

Penicilina 10 UI > 28 S < 0.007-0.015 S ND ND
Ceftriaxona 30 µg > 28 S < 0.015 S ND ND
Eritromicina 15 µg 9-15 R2 8-16 R 12-16 R0
Clindamicina 2 µg 21-27 S2, 3 < 0.015 S ND ND
Azitromicina 15 µg ND ND 32-64 R ND ND
Lincomicina 10 µg 19-24 S2 ND ND ND ND
Pristinamicina I 40 µg 19-23 S2 ND ND ND ND
Pristinamicina II 20 µg 19-21 S2 ND ND ND ND
Espiramicina 100 µg 22-26 S2 ND ND ND ND

1 Categoría: S = sensible, I = con sensibilidad intermedia, R = resistente, ND: no determinado
CIM: concentración inhibitoria mínima.
2 Estos resultados corresponden al esquema recomendado por Leclercq y Courvalin para poder reconocer los mecanismos involucrados en la resistencia a macrólidos13.
3 Ningún aislamiento presentó antagonismo clindamicina-eritromicina por el método del doble disco