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OLIGONUCLEOTIDOS
ANTISENSE
LOS OLIGONUCLEOTIDOS
ANTISENSE POTENCIAN LA APOPTOSIS INDUCIDA POR LA IDARUBICINA EN LA
LINEA CELULAR K-562*
LUCIANO VELLON, TERESA
CUELLO, PATRICIA GARGALLO, IRENE LARRIPA
Departamento de
Genética, Instituto de Investigaciones Hematológicas, Academia
Nacional de Medicina, Buenos Aires
* Este trabajo mereció
el Premio Cherny otorgado por la Sociedad Argentina de
Investigación Clínica (SAIC) durante su reunión anual en Mar
del Plata, noviembre 1999.
Key words: chronic myelogenous leukemia, apoptosis,
antisense, idarubicin, K-562
Resumen
La
línea celular K-562, portadora del rearreglo bcr/abl de tipo b3a2
es resistente a la apoptosis inducida por inhibidores de
topoisomerasa II. Se trataron células de dicha línea con
complejos de liposomas catiónicos (DMRIE-DOPE y Dcchol-DOPE) y
oligonucleótidos antisense (ODNs AS) dirigidos contra el ARNm
bcr/abl de tipo b3a2, y non sense (ODNs NS), en una razón 3:1
lípido/ADN, durante 72 horas, luego se incubaron durante 24 horas
con idarubicina (IDA), 0.5 µg/ml, para inducir apoptosis. La
misma se evaluó por observación morfológica al microscopio de
fluorescencia. Las células tratadas con los conjugados DMRIE-DOPE
y Dcchol/DOPE con el ODN AS específico mostraron un mayor
porcentaje de apoptosis inducida por IDA (X ± DS: 14.74 ± 2.07 y
20.43 ± 4.58, respectivamente) comparadas con los controles no
tratados con ODNs (X ± DS: 8.08 ± 0,82); (p < 0.005). Los
datos indican que los ODNs-AS dirigidos contra el ARNm bcr-abl de
tipo b3a2 vuelven a las células de la línea K-562 sensibles a la
IDA a la concentración mencionada.
Abstract
Antisense
oligonucleotides increase the apoptotic effect of idarubicin in
K-562 cell line. The cell line K-562, which carries bcr/abl
rearrangement of type b3a2 is resistant to apoptosis induced by
topoisomerase II inhibitors. K-562 cells were treated with
complexes of cationic liposomes (DMRIE-DOPE and Dcchol-DOPE) and
antisense oligonucleotides (AS-ODNs) directed against the b3a2
type of bcr/abl mRNA and non sense oligonucleotides (NS-ODNs), in
a 3:1 lipid/DNA ratio during 72 hours, then they were incubated
for a further 24 hours with idarubicin (IDA), 0.5 µg/ml, to
induce apoptosis. It was evaluated by morphology to the microscope
of fluorescence. Cells treated with the complexes DMRIE-DOPE and
Dcchol/DOPE with the specific AS-ODN showed a higher apoptosis
percentage induced by IDA (X ± SD: 14.74 ± 2.07 and 20.43 ±
4.58, respectively) compared with controls not treated with ODNs
(X ± SD: 8.08 ± 0.82); (p < 0.05). These data indicate that
the AS-ODNs directed against the b3a2 type of bcr-abl mRNA renders
the cell line K-562 sensitive to IDA at the mentioned
concentration.
Dirección postal: Dra. Irene Larripa, Departamento de
Genética, Instituto de Investigaciones Hematológicas, Academia
Nacional de Medicina, P. Melo 3081, 1425 Buenos Aires, Argentina
Fax: (54-11) 4805-0712 E-mail: lacuteci@intramed.net.ar
La característica citogenética de la Leucemia Mieloide
Crónica (LMC) es una translocación recíproca balanceada entre
los cromosomas 9 y 22 t(9; 22) (q34; q11)1. El resultado de esta
translocación es un gen híbrido BCR/ABL y una proteína de
fusión, p210bcr/abl. Esta proteína posee una actividad tirosina
quinasa incrementada, comparada con el producto normal del gen
c-abl2. Hay evidencia de que la p210bcr/abl puede actuar como un
factor antiapoptótico3. Se han usado oligonucleótidos antisense
dirigidos al sitio de empalme del ARNm bcr/abl, para correlacionar
el efecto de los mismos con una disminución del transcripto
bcr/abl o de su producto proteico4, 5.
La línea celular K-562, derivada de un paciente con LMC en crisis
blástica y portadora del cromosoma Philadelphia6, es resistente a
la apoptosis inducida por una variedad de agentes, (irradiación,
luz UV, inductores químicos e inhibidores de la síntesis
proteica)7. La disminución de la síntesis de la p210bcr7abl en
la línea K-562 vuelve a éstas células más susceptibles a la
inducción de la apoptosis por agentes químicos o carencia de
suero7, 8.
En el presente trabajo se utilizaron oligonucleótidos antisense
naturales (ODN-AS) de 18 bases, dirigidos contra el ARNm bcr/abl
en la línea celular K-562 y oligonucleótidos non sense (ODN-NS),
con la misma composición de bases que el AS-ODN pero con una
secuencia aleatoria. Las células se incubaron en RPMI 1640 con 1
µg/ml de los oligonucleótidos (ODNs). Para incrementar el uptake
de los mismos, se utilizaron dos formulaciones de liposomas
catiónicos, DCCHOL/DOPE (3 beta [N-(N’, N’-dimetilaminoetano)-carbamoil]
colesterol/(1,2-dioleil-fosfatidiletanolamina) y DMRIE/DOPE
(1,2-dimiristopropil-3-dimetil-hidroxietil bromuro de
amonio)/(DOPE). Para la formación de los complejos lípido: ADN,
se disolvieron los ODNs y los liposomas en un volumen total de 20
µl de medio de cultivo, en una relación lípido: ADN de 3:1 p/p
y se los dejó durante 20 minutos a temperatura ambiente, luego de
lo cual se adicionaron gota a gota a la suspensión celular
(50x103 células en 180 µl de RPMI 1640). En estas condiciones,
se realiza la transfección, durante 12 horas. Posteriormente, se
completó con medio de cultivo hasta un volumen total de 500 µl y
un 10% de suero fetal bovino. Se incubaron de este modo las
células durante 72 horas. Luego de este período se incubaron
durante 24 horas con el inhibidor de Topoisomerasa II Idarubicina
(IDA) a una concentración de 0.5 µg/ml, a fin de inducir la
apoptosis.
Las células apoptóticas se detectaron por observación al
microscopio de fluorescencia, utilizándose para ello una mezcla
de los fluorocromos naranja de acridina y bromuro de etidio.
También se observó al microscopio de fluorescencia el uptake de
oligonucleótidos marcados con isotiocianato de fluoresceína
(FITC) en el extremo 3', para lo cual se realizó el tratamiento
de las células con los complejos lípido: ADN del modo
mencionado, y se observó el uptake de los ODNs a las 2 y a las 24
horas de realizada la transfección. Para esto se fijaron las
células en paraformaldehído al 2% en PBS durante 20 minutos a
temperatura ambiente, se goteó la suspensión de células fijadas
en un portaobjetos tratado con xylane, luego de lo cual, se
efectuó un lavado durante 5 minutos en 2X SSC, se coloreó con
una solución de DAPI (4.6-diamino 2-fenil indol) 0.2 µg/ml en 2X
SSC durante 10 minutos, y por último se efectuó un lavado en 2X
SSC con un 0.05% de nonidet-P40 (NP-40). Se colocó medio de
montaje y se procedió a la observación al microscopio de
fluorescencia.
Las células tratadas con los conjugados DMRIE-DOPE y DCCHOL/DOPE
con el ODN AS específico para el rearreglo b3a2 mostraron un
mayor porcentaje de apoptosis inducida por IdA (X ± DS: 14.74 ±
2.07 y 20.43 ± 4.58, respectivamente) comparadas con los
controles no tratados con ODNs (X ± DS: 8.08 ± 0.82); (p <
0.005) (Fig. 1). Los cultivos con ODN-NS no difirieron
significa-tivamente de los controles. En cuanto al uptake y
distribución intracelular de los ODNs, se observó al microscopio
de fluorescencia que los ODNs presentan una localización
citoplasmática, en estructuras del tipo vesicular a las 2 horas
de la transfección, con la utilización de las formulaciones
lipídicas, mientras que sin las mismas no son tomados por las
células en ese tiempo. A las 24 horas, se observa en las células
tratadas con los complejos lípido: ADN que la distribución de
los ODNs es predominantemente citoplasmática, observándose las
estructuras de tipo vesicular y una pequeña fracción de células
en las que la localización de los ODNs es nuclear.
Las observaciones realizadas sugieren que, con la utilización de
las formulaciones lipídicas, los ODNs son captados de forma más
rápida y eficiente por las células de la línea K-562, pues a
las dos horas de realizada la transfección se observa una
distribución citoplasmática de los ODNs, mientras que la
penetración espontánea de los mismos es poco eficiente.
La localización de los ODNs en supuestas estructuras vesiculares
sugiere que los ODNs serían tomados activamente por endocitosis,
y estos gránulos podrían representar endosomas y lisosomas, que
liberarían los ODNs al citoplasma y serían importados al
núcleo9.
Por otra parte, nuestros datos muestran que el citostático IDA a
0.5 µg/ml no indujo un incremento significativo en la apoptosis a
las 24 hs del tratamiento. El pretratamiento con ODNs sin utilizar
los lípidos tampoco modificó los porcentajes de apoptosis. Sin
embargo el tratamiento previo con ODN-AS conjugados con las
formulaciones lipídicas (DCCHOL/DOPE y DMRIE/DOPE) elevó
significativamente (p < 0.005) los porcentajes de apoptosis
inducida por IDA en las condiciones mencionadas, sugiriendo que el
tratamiento con ODN-AS dirigidos contra el ARNm bcr/abl puede
revertir la resistencia a la apoptosis en células de la línea
K-562.
Agradecimientos: Queremos agradecer a los Dres. Gerardo
Glikin y Armando Carara por habernos facilitado las formu-laciones
lipídicas empleadas y por sus valiosos consejos.
Bibliografía
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chronic myelogenous leukemia identified by quinacrine fluorescence
and giemsa staining. Nature 1973; 243: 290-3.
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abelson tyrosine kinase activity is associated with suppression of
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inhibition of leukemia cell proliferation by bcr/abl antisense
oligodeoxynucleotides. Science 1991; 253: 562-5.
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Oligo-deoxyribonucleotide uptake in primary human hema-topoietic
cells is enhanced by cationic lipids and depends on the
hematopoietic cell subset. Blood 1998; 91: 852-62.
Fig. 1.– a y b: porcentajes de apoptosis obtenidos con los ODNs
a una concentración de 1 µg/ml conjugados con las formulaciones
DCCHOL/DOPE (a) y DMRIE/DOPE (b). Referencias: control, cultivos
sin ODNs. L6, ODN complementario al sitio de empalme del ARNm
bcr/abl del tipo b2a2. K28, ODN complementario al sitio de empalme
del ARNm bcr/abl del tipo b3a2. NS, oligonucleótido nonsense.
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I seem to have been only like a boy playing on the sea-shore, and
diverting myself in now and then finding a smoother pebble or a
prettier shell than ordinary, whilst the great ocean of truth lay
all undiscovered before me.
Me parece que he sido como un niño que jugara en la playa, y
que me divirtiera cuando hallaba alguna piedrita muy pulida o una
concha más bonita que las comunes, mientras el gran océano de la
verdad permanecía ante mí totalmente desconocido.
Isaac Newton (1642-1727)
Brewster’s Memoirs
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