Patología por Trypanosoma cruzi ¿Cepa dependiente?

Stella M. GonzAlez Cappa, Gerardo A. Mirkin, Maria E. Solana, Valeria S. Tekiel

Departamento de Microbiología, Parasitología e Inmunología, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires

Key words: Trypanosoma cruzi, parasite subpopulations, pathology, immunopathology, autoimmunity, T lymphocytes, antibodies, congenital transmission.

Resumen

En la actualidad existe consenso en el papel que las características de la población de Trypanosoma cruzi tienen en la patogénesis de las distintas formas clínicas de la enfermedad de Chagas. En nuestro laboratorio, estudiamos en el modelo murino las consecuencias de la infección con dos poblaciones de características biológicas polares: RA y CA-I. Demostramos que el daño neuromuscular es, en parte, mediado por diferentes subpoblaciones de linfocitos T. Además, observamos que el fenotipo celular responsable de la patología y los distintos blancos tisulares dependen de la población parasitaria. A pesar de no haber observado diferencias en la reactividad de los sueros de ratones infectados con RA y CA-I frente a estructuras nativas del nervio, la respuesta humoral jugaría un papel adicional en el desarrollo de la patología neuromuscular: sueros de ratones infectados con RA, pero no con CA-I, desencadenaron alteraciones en el potencial de acción nerviosa. También hemos detectado, en el modelo murino, una disminución en la fertilidad de las hembras infectadas con CA-I/K-98, mientras que las hembras infectadas con RA se comportaron igual a los controles. Sin embargo, sólo pudo comprobarse pasaje transplacentario de T.cruzi en la cepa RA. Las diferencias encontradas en la fertilidad, en la sobrevida de las crías nacidas de madres infectadas, así como en el número de resorciones fetales detectadas con la cepa miotrópica, podrían atribuirse a la respuesta inflamatoria hallada en el útero de estas hembras, ya que no se observaron alteraciones en el estro de ambos grupos infectados con respecto a los controles.

Abstract

Is Trypanosoma cruzi pathology strain dependent? There is agreement today about the role that the characteristics of the population of Trypanosoma cruzi play in the pathogenesis of the different clinical forms of Chagas disease. In our laboratory, we have studied the outcome of the infection of mice with two populations with polar biological behaviour: RA and CA-I. We have demonstrated that the neuromuscular damage is, in part, mediated by different T cell subsets. We have also observed that the T cell phenotype responsible for the pathology and the targetted tissues depend on the parasite population. Although we found no differences regarding the reactivity of IgG to native nerve structures in sera from mice infected with either strain, it is presumed that the humoral response would play an additional role in the development of strain-dependent neuromuscular pathology since passive transfer of sera from mice infected with RA triggered alterations of the nerve action potential whereas sera from CA-I-infected mice did not. We have also detected a reduction in the fertility of female mice infected with CA-I/K98, whereas females infected with RA showed no difference in comparison with uninfected controls. However, congenital transmission was only observed in mice infected with RA. The differences observed in fertility, in newborn survival, and in the number of fetal resorptions in mice infected with the myotropic strain could be attributed to the uterine inflammatory response, since no estrous alterations were observed between infected and control groups.

Dirección postal: Dra. Stella M. González Cappa, Departamento de Microbiología, Facultad de Medicina, Paraguay 2155, 1121 Buenos Aires, Argentina
Fax: (54-11)4963-7078 E-mail: smgcappa@fmed.uba.ar

La enfermedad de Chagas presenta diferentes formas clínicas1-3. También se sabe desde hace tiempo que el Trypanosoma cruzi presenta variación intraespe-cífica4. En nuestro laboratorio estamos interesados en establecer cuál es la responsabilidad de las cepas en desencadenar patología y para ello procedimos a aislar y caracterizar cepas de T. cruzi de pacientes tanto con enfermedad de Chagas aguda como con infección crónica. En este momento contamos con dos poblaciones parasitarias que difieren polarmente en diversas de sus características biológicas: la cepa RA y la CA-I. Además, un clon de esta última, K-98, presenta un comportamiento biológico prácticamente indistinguible del de su cepa madre por lo que nos referiremos a éstos como CA-I/K-98.
Las características generales de estas dos poblaciones se muestran en la Tabla 1. La cepa RA es altamente letal para el ratón, en circulación predominan las formas delgadas, estimula la producción de anticuerpos (Ac) con capacidad para interferir con la viabilidad del estadio circulante (con función lítica, opsonizante y neutra-lizante) y presenta alta capacidad para interiorizarse y multiplicarse tanto en células fagocíticas como no fagocíticas. Por el contrario, CA-I/K-98 no es letal para el hospedero murino, en circulación predominan las formas gruesas, es ineficiente para gatillar Ac efectivos contra la forma circulante del parásito y su capacidad para interiorizarse y multiplicarse intracelularmente es baja comparada con la cepa RA5-8. En relación al tropismo tisular in vivo, CA-I/K-98 es altamente miotrópica mientras que RA, que se define habitualmente como reticulotrópica, es en realidad pantrópica7, 8.
En un modelo que hemos desarrollado en el laboratorio para estudiar el arco médula espinal dorso lumbar-nervio ciático-músculo esquelético y que denominamos “modelo de sistema nervioso periférico” (SNP)9, estas 2 poblaciones presentan un patrón de patología diferente. Los estudios electrofisiológicos e histopatológicos reflejan compromiso neuropático primario en los animales infectados con la cepa RA y, opuestamente, los animales infectados con CA-I/K-98 presentan compromiso miopático primario (Tablas 1 y 2)10.
En este modelo también se registran diferencias cuanti y cualitativas en los infiltrados tisulares. En la infección con RA los infiltrados en nervio y médula espinal son de mayor tamaño que los que se detectan con CA-I/K-98, pero al considerar músculo esquelético esto se invierte. En relación a su composición, si bien en ambos casos se observan linfocitos T (LT) CD4+, LT CD8+ y macró-fagos, en la infección con la cepa pantrópica RA predominan los LT CD8+ mientras que con la miotrópica el predominio de este fenotipo sólo se ve en músculo esquelético en el período crónico tardío, cuando los infiltrados alcanzan su mayor tamaño. Además, en las lesiones musculares de los ratones infectados con RA hay células NK y en las de sistema nervioso hay células con doble marcación negativa# , mientras que en ratones infectados con la cepa miotrópica hallamos linfocitos BsIgM+ y depósitos de IgG. (Tabla 1)10.
Con estos antecedentes nuestro interés y primer objetivo fue estudiar el papel de los LT y de los Ac en la inducción de patología en este modelo de SNP.
Paralelamente nos interesó indagar qué sucede en un sitio particular para la respuesta inmune como es la placenta, donde debe existir un perfil de citoquinas Th2 para que no se produzca el rechazo del feto11. Para ello estandarizamos un segundo modelo que denominaremos de “transmisión congénita” inoculando hembras adultas con dosis óptimas de cada cepa de T. cruzi para lograr cronicidad en la infección y máxima respuesta inmune5. En estos experimentos preliminares comprobamos que los ratones hembras inoculados con la cepa miotrópica CA-I/K-98, pero no los infectados con la cepa pantrópica RA, presentaban alteraciones de la fertilidad que resultaban en una disminución significativa tanto en el número de hembras preñadas como en el número de crías por hembra; en las pocas crías que nacían no se registraba transmisión del parásito. En las hembras inoculadas con RA, en cambio, si bien no se alteraba la preñez, se registraba una tasa de transmisión de T. cruzi cercana al 4%.
Por lo tanto, nuestro segundo objetivo fue iniciar estudios tendientes a establecer las causas de la disminución de la fertilidad en las hembras infectadas con parásitos CA-I/K-98.
En cumplimiento del primer objetivo y para verificar la responsabilidad que los LT tenían en la producción de daño, primero analizamos si eran capaces de reconocer tejido muscular y nervioso del huésped. Para ello se realizaron estudios de proliferación de LT CD4+ y LT CD8+ de ratones infectados con CA-I/K-98 ó RA, frente a homogenatos de músculo esquelético, nervio ciático y médula espinal obtenidos de ratones normales. En el caso de la cepa miotrópica se observó que ambos fenotipos linfocitarios proliferaban frente a los tres complejos antigénicos aunque su grado de reactividad era bajo. Por otra parte, cuando se ensayaron LT obtenidos de ratones infectados con RA, sólo se registró proliferación frente a Ag de sistema nervioso, alcanzando niveles de respuesta elevados. Estos resultados se muestran en la Figura 112. Pensamos que esto podía deberse a una activación policlonal en el primer caso y a un reconocimiento específico en el segundo, por lo que decidimos realizar transferencia pasiva de ambos fenotipos de LT, a ratones singeneicos no infectados, a fin de verificar si eran capaces de producir patología.
Para ello utilizamos como dadores, ratones con infección crónica por ambas cepas de T. cruzi. Se purificaron los LT CD4+ y CD8+ y se transfirieron a receptores singeneicos normales. En éstos verificamos que, cuando transferíamos LT CD4+ de ratones infectados con la cepa miotrópica CA-I/K-98, el blanco tisular era músculo. La transferencia de LT CD8+ no indujo patología. En cambio, cuando se transfirieron linfocitos de ratones infectados con RA, ambos fenotipos fueron capaces de producir daño, siendo nervio ciático el blanco de la lesión (Tabla 3). En todos los casos en los infiltrados se registraba la presencia de macrófagos, LT CD4+ y LT CD8+. En aquellos ratones que habían recibido LT de animales infectados con la cepa pantrópica RA, se observaban además células doble negativas12. Recordemos que los ratones infectados con esta misma cepa presentaban en los infiltrados de músculo esquelético células NK y que en sistema nervioso (donde técnicamente no podíamos buscar células NK) se encontraban células no marcadas10. En ninguno de los tejidos que presentaba lesión pudo detectarse la presencia de parásitos mediante PCR12.
En resumen, los LT de ratones infectados son capaces de transferir patología. El fenotipo y el blanco tisular de la agresión dependen de la cepa de T. cruzi utilizada para infectar al dador.
A fin de analizar si los Ac tienen algún papel en la patogenia de la lesión, iniciamos el estudio de los sueros evaluando si eran capaces de reconocer Ag de sistema nervioso y músculo esquelético murinos por Western-blot. Con este propósito evaluamos la reactivi-dad de sueros anti-RA y anti-CA-I/K-98 contra Ag de músculo esquelético, médula espinal, nervio ciático y cerebro obtenidos de ratones singeneicos normales. Independientemente de la población parasitaria usada en la infección, todos los sueros que reconocieron Ag murinos (93,7%) reaccionaron con algún tejido de sistema nervioso. En todos los casos el patrón de bandas revelado fue altamente heterogéneo no encontrándose perfil alguno que correlacionara polipéptidos detectados con cepa infectante y/o tiempo post-infección (pi). Por el contrario, la reactividad frente a Ag de músculo esquelético fue sólo relevante en los sueros crónicos de ratones infectados con CA-I/K-98. Cuando se analizaron estos sueros mediante IFI en cortes de tejidos de ratones normales, se observó reactividad de IgG frente a matriz intersticial de nervio ciático, tanto en sueros anti-RA como anti-CA-I/K-98. También se observó reactividad de IgG frente a músculo esquelético, independientemente de la población de T. cruzi infectante13.
Con el propósito de confirmar si estos sueros autorreac-tivos participaban en la producción de daño en SNP, se decidió realizar ensayos de transferencia pasiva por vía perineural. Sueros de ratones infectados con las cepas RA y CA-I/K98, con reactividad positiva contra nervio ciático por Western-blot y/o IFI, se inocularon en ratones singeneicos normales y a los 4 días post-transferencia se registró in vivo la latencia y amplitud del potencial de acción nervioso (PAN) del nervio ciático. Como controles negativos se utilizaron animales inoculados con suero normal y como controles positivos, ratones inoculados con parásitos viables, utilizando la misma vía. Se verificó que los sueros anti-RA inducían alteraciones significativas del PAN, con aumento de la latencia y disminución de la amplitud, cuando se utilizaban sueros que habían reconocido el tejido nervioso por IFI, independientemente de la reactividad evidenciada por Western blot. Por otra parte, los sueros anti-CA-I/K-98 no indujeron modificación alguna sobre el patrón de conducción nerviosa, aún cuando fueran reactivos por IFI (manuscrito en preparación) (Tabla 4). Estas alteraciones indican que, dependiendo de la población parasitaria utilizada en la infección, existen factores humorales reactivos contra antígenos de mielina en su estructura nativa, con capacidad de afectar el número de axones funcionantes y la velocidad de conducción. Además, estos resultados reafirman que ambas poblaciones parasitarias inducen Ac con diferente funcio-nalidad5, 8.
Con el objeto de cumplir con el segundo objetivo planteado, nos propusimos averiguar las posibles causas que determinan la disminución de la fertilidad en hembras infectadas con CA-I/K-98. Al estudiar el ciclo estral de animales infectados y controles, encontramos que todos los grupos desarrollaban el estro sin diferencias significativas y en forma asincrónica. El próximo paso fue analizar si existían interferencias en la fecundación para lo cuál se determinó el número de hembras que se preñaban y el tiempo que esto requería desde el momento en que se establecían las parejas. Comprobamos que todas las hembras infectadas requerían mayor tiempo de “convivencia” con los machos para preñarse, pero mientras que aquellas infectadas con RA alcanzaban este estado en el 100% de los casos, las infectadas con la cepa miotrópica no se preñaban en su totalidad aún después de 2 meses y medio. Así, en un ensayo con 10 hembras por grupo, todos los controles se preñaron al cabo de 35 días, las infectadas con RA a los 70 días, mientras que sólo el 70% de las infectadas con CA-I/K-98 estaban preñadas a los 75 días (Tabla 5). Esta dificultad, que se expresa por requerir un mayor período de contacto con el macho, podría estar relacionada con alteraciones funcionales de la musculatura y del SNP, que dificulten mecánicamente el acto de la cópula, ya que no puede atribuirse a diferencias en el ciclo estral.
El tercer punto fue determinar si existían diferencias en el número resorciones fetales desarrolladas por hembras infectadas y controles. En este caso observamos que el comportamiento de los ratones infectados con RA no difería del de los controles, mientras que en el grupo infectado con CA-I/K-98 su frecuencia era mayor marcando un tendencia en el límite con la significación estadística. Los valores, expresados como índice de frecuencias de resorciones fueron 0,10 para el grupo control vs 0,12 y 0,32 para los grupos infectados con RA y con CA-I/K-98.
El último punto fue analizar el cuadro histopatológico presente en el aparato reproductor en hembras infectadas con una u otra población parasitaria. A los 30 días pi, y diferenciándose de los controles y del grupo infectado con RA, en las hembras infectadas con la cepa CA-I/K-98 miotrópica se registró endo y miometritis (Tabla 5); en ambos grupos se detectó periooforitis pero de intensidad moderada para la cepa miotrópica y leve para RA. Actualmente estamos estudiando la composición de estos infiltrados. Avalando la hipótesis de que la infección pudiese resultar en una dificultad mecánica para el éxito de la cópula, se registró miositis en músculo esquelético más intensa (moderada a grave) en los ratones con infección por CA-I/K-98, que en los infectados con RA (leve a moderada).
Nuestras conclusiones hasta el momento son:
l Los LT transfieren daño. El fenotipo responsable al igual que el blanco tisular serían dependientes de la cepa de T. cruzi.
l Los sueros reactivos que reconocen antígenos de tejido nervioso en su forma nativa, modifican la velocidad de conducción. Esta acción estaría diferencialmente inducida según la cepa del parásito infectante.
l El grado de fertilidad de las hembras infectadas con T. cruzi es dependiente de la cepa infectante. Su disminución es independiente del desarrollo del ciclo estral. Se relacionaría con retardo en la preñez, tendencia a mayor frecuencia de resorciones fetales y a la presencia de infiltrados uterinos.

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TABLA 1.– Características de las cepas en el modelo murino

Características RA CA-I / K98

l Letalidad alta nula o escasa
l Estadío circulante
C Forma predominante delgada gruesa
· Anticuerpos
C líticos, opsonisantes, si no
neutralizantes
l Tropismo in vivo reticulotrópico/ miotrópico
pantrópico
l Estudios in vitro en
células Vero y MØ
C Interiorización 4-5 veces 1 vez
C Multiplicación alta baja
l Patrón de patología
C Electrofisiológico compromiso neuro- compromiso mio-
pático primario pático primario C Infiltr. histopatológicos
En nervio ++/+++ +
En músculo + +++
Caract. diferenciales NK LBs IgM
Depósitos IgG
C Fenotipo celular predom.
En nervio CD8 CD4=CD8
En músculo CD8 CD4/CD8 *

* Cambia fenotipo predominante con el aumento del infiltrado en el tiempo.
TABLA 2.– Cambios electrofisiológicos e histológicos en músculo y en nervio inducidos por la infección con Trypanosoma cruzi

Característica CA-I/K-98 RA

I-Electromiografía
Potencial de unidad motora
Amplitud disminuída aumentada
Duración disminuída aumentada

II-Histopatología
A- Cambios en músculo
Miopáticos
C centralización nuclear +++ +/++
C reemplazo por fibrosis y degeneración grasa +++ +/++
C splitting de miofibras ++ +
C fibras de tamaño variable ++ +

Neuropáticos
C atrofia aislada de miocélulas + ++
C atrofia agrupada de fibras musculares + ++

B- Cambios en nervio
C Degeneración axonal + ++
C Cámaras de digestión de mielina + ++
TABLA 3.– Lesiones en receptores de subpoblaciones de linfocitos T

Dadores Receptores
Cepa Fenotipo LT Músculo Nervio

K98 CD4 + -
CD8 - -
RA CD4 - +
CD8 - +
TABLA 4.– Efecto producido por la transferencia pasiva via perineural, de sueros de ratones infectados

Característica RA CA-I/K-98

Potencial de acción latencia aumentada no se modifica
de nervio amplitud disminuída no se modifica

Alteraciones del PAN reconocimiento de ––––––
se relacionan con: estructuras nativas
del antígeno

TABLA 5.– Fertilidad en la infección por T. cruzi

Caracteristicas RA CA-I/K-98

Ciclo estral + +
Preñez demorada demorada
Alcanza 100% No alcanza 100%
Resorciones Sin diferencias Mayores#
Infiltrados
inflamatorios uterinos Ausentes Presentes

# tendencia en el límite de la significación estadística con relación al grupo control no infectado.
# El marcador utilizado para NK (asialo-GM1) se expresa constituti-vamente en sistema nervioso por lo que no se pudo confirmar ni descartar su presencia en este tejido.

Fig. 1– Autorreactividad en la neuromiopatía chagásica expe-rimental. Respuesta proliferativa (incorporación de 3H-timidina) mediada por linfocitos T CD4 y CD8 de ratones infectados con las cepas RA y CA-I/K98 de Trypanoso-ma cruzi (4 meses pi), frente a homogenatos totales de músculo esquelético (A), nervio ciático (B) y médula espinal (C).