RESPUESTA TH1 EN LA INFECCION EXPERIMENTAL CON TRYPANOSOMA CRUZI

RITA L. CARDONI , MARIA INES ANTUNEZ, ANALIA A. ABRAMI

Instituto Nacional de Parasitología Dr. M. Fatala Chabén (INP), ANLIS Dr. C.G. Malbrán, Buenos Aires

Key words: Trypanosoma cruzi, IL-12, IFN-g, NK activity

Resumen

En el huésped infectado con Trypanosoma cruzi, la respuesta inmune protectora involucra principal- mente la producción de anticuerpos específicos y la activación de células fagocíticas por interferón-g (IFN-g). El efecto central del IFN-g in vivo sería la activación de la sintetasa inducible de óxido nítrico de macrófagos (iNOS) y la generación de óxido nítrico (NO°) que participa en la destrucción intracelular de los parásitos. En la infección aguda, la inducción de la respuesta TH1 sería llevada a cabo por la interleuquina 12 (IL-12), que estimula la producción de IFN-g en células NK. En la liberación de IFN-g también intervienen otros tipos de células, como los linfocitos Thy-1+CD4-CD8-, CD4+ y CD8+. El control de la respuesta TH1, podría ser, en parte, el resultado de la menor activación de macrófagos, por la disminución de la carga parasitaria, y de la producción de IL-10 y del factor de transformación del crecimiento b (TGF-b). La respuesta protectora TH1 también estaría implicada en el daño tisular y en las alteraciones de la respuesta inmune observadas durante la infección. Nosotros estudiamos la cinética de la actividad NK y de la producción de IL-12 e IFN-g por células de bazo, así como los niveles séricos de estas citoquinas centrales de la respuesta TH1, en ratones BALB/c y C3H infectados con T. cruzi, cepa Tulahuén. Inmediatamente después de la infección encontramos que, en las células de bazo, incrementó tanto la producción de IL-12 como la actividad NK, y este efecto fue mayor en ratones C3H que en BALB/c. En los C3H, el IFN-g aumentó simultáneamente, a diferencia de los BALB/c en los que la citoquina incrementó más tardíamente en la fase aguda. En ambas cepas, la infección indujo muy rápidamente altos niveles séricos de IL-12 que se mantuvieron elevados durante toda la fase aguda. Por otro lado, el IFN-g sérico incrementó unos días antes del pico de parasitemia y alcanzó mayor concentración, y más tempranamente, en los ratones BALB/c que en los C3H. Para nuestra sorpresa, en la fase crónica de la infección, la producción de IL-12 seguía alta en ambas cepas, a pesar de ello, el IFN-g sólo continuó elevado en los ratones BALB/c. Aunque en la fase aguda la respuesta global fue predominantemente TH1 en las dos cepas de ratones, los BALB/c tienen una mayor susceptibilidad que los C3H. El control inicial del parásito parecería estar más relacionado con la expresión de la respuesta TH1 a nivel de células del bazo, mientras que los niveles séricos de IL-12 e IFN-g podrían estarlo con la inducción del daño tisular. Nuestras observaciones indicarían que la respuesta protectora TH1 tendría diferente modalidad en diferentes relaciones huésped-parásito, y que los factores que la controlan son de importancia primaria para determinar la expresión cuali- y cuantitativa de la relación IL-12/NK/IFN-g y su participación en la resistencia y en el daño tisular.

Abstract

TH1 response in the experimental infection with Trypanosoma cruzi. Specific antibodies and the activation of phagocytic cells by IFN-g are the key elements of the immune response involved in protection of the T. cruzi infected host. The central role of the IFN-g in vivo seems to be the activation of the inducible nitric oxide synthetase of macrophages (iNOS) and the production of nitric oxide (NO°) for the intracellular destruction of the parasite. Interleukin 12 (IL-12), the cytokine that stimulates NK cells for IFN-g production, seems to trigger the TH1 response in the acute phase. Other cell types, such as lymphocytes Thy-1+CD4-CD8-, CD4+ and CD8+, are also involved in IFN-g production. The down regulation of the TH1 response could in part depend on the decrease in the macrophage activation, as a result of the controlled parasite burden, and on the production of IL-10 and transforming growth factor b (TGF-b). The protective TH1 immune response seems to be also related to both the tissue damage and the alterations of the immune response observed during the infection. We studied the kinetics of both NK cell activity, and the production of IL-12 and IFN-g by spleen cells, as well as the seric levels of these cytokines, in BALB/c and C3H mice infected with T. cruzi, Tulahuén strain. In the spleen, we found that the production of IL-12 and the NK cell activity increased in the very early acute infection, and that in C3H the effect was higher than in BALB/c mice. IFN-g increased in C3H at the same time, but in the BALB/c strain it increased later in the acute phase. The infection induced a very early increase in the seric levels of IL-12, that remained high throughout the acute phase, in both mouse strains. However, the levels of IFN-g in the serum increased a few days before the peak of parasitemia, reaching higher values, and earlier, in BALB/c than in C3H mice. Surprisingly, in the chronic infection IL-12 production remained high in both mouse strains, but IFN-g production was only observed in BALB/c mice. The immune response was predominantly TH1 in both mouse strains, in spite of the higher susceptibility of BALB/c compared to C3H. The early control of the parasite burden could be evaluated as the expression of the TH1 response in spleen cells, while the seric levels of IL-12 and IFN-g would be related to the induction of tissue damage. Our data indicate that the protective TH1 immune response has a different expression according to the host-parasite relationship, and that the factors controlling the response are of primary importance to determine the quali- and quantitative expression of IL-12/NK/IFN-g as well as their involvement in resistance and tissue damage.

Dirección postal: Dra. Rila L. Cardoni, Instituto Nacional de Parasitología, Av. Paseo Colón 568, 1063 Buenos Aires. Fax: (54-11)4331-7142 E-mail: rita@inscha.gov.ar

En nuestro país, la alta prevalencia de la infección por Trypanosoma cruzi, asociada a la alta densidad de población en la zona endémica, constituye un serio problema sanitario1. Esto se debería, paradójicamente, a que a pesar de la buena adaptación del T. cruzi, reflejada en el bajo porcentaje de los infectados que desarrollan sintomatología clínica, existe un gran número de individuos crónicamene infectados1, 2.
La resistencia a la infección con T. cruzi ha sido asociada con la mayoría de los mecanismos inmunes efectores conocidos, que fueron estudiados principal-mente en modelos experimentales en los que los ratones desarrollan altas parasitemias. En estos casos, los principales mecanismos efectores para el control del parásito en la etapa aguda serían los anticuerpos específicos3, dependientes de linfocitos T CD4+.4, y el incremento de la actividad tripanocida de células fagocíticas por IFN-g.5, 6. Esta citoquina induce la activación de la iNOS con el consecuente incremento de NO°7. En presencia de IFN-g, la coestimulación de macrófagos por otros mediadores, como el factor necrosante de tumores a (TNF-a)8 y el factor estimulador de la formación de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF)9, produce un incremento adicional de la producción de NO° y de la destrucción intracelular de los parásitos. La deficiencia en la expresión de iNOS o del receptor para el IFN-g impide la sobrevida del huésped infectado con T. cruzi.10.
La respuesta inmune adquirida a infecciones se considera TH1 o TH2 de acuerdo al perfil de citoquinas que se produce preferentemente. La respuesta TH1 se caracteriza por la liberación de IL-2, IFN-g y linfotoxina (o TNF-b), mientras que IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 e IL-13 están asociadas con la respuesta TH211. La IL-12 induce la producción de IFN-g por células NK, en la respuesta no-adaptativa, así como por células T para el desarrollo de la respuesta TH1 específica12. En la infección con T. cruzi, esta citoquina es liberada durante la fagocitosis o la invasión de monocitos/macrófagos por el parásito13. Otras citoquinas, como la IL-1514 y la IL-1815 también están involucradas en la activación de células NK y en la producción de IFN-g, pero en nuestro conocimiento, aun no ha sido evaluada su actividad biológica en la infección con T. cruzi.
En la etapa aguda de la infección se detecta muy tempranamente un incremento de los niveles del ácido ribonucleico mensajero (ARNm) para IL-12 e IL-18 en el bazo15 y se observa globalmente una respuesta TH1 con producción de IFN-g16, 17, activación de macrófagos18 y predominio, T-dependiente, de anticuerpos IgG2a sobre IgG119. La administración de anticuerpos anti-IL-12 incrementa la susceptibilidad a la infección, indicando que esta citoquina se produce in vivo y juega un papel en la resistencia13, 20. Además, el tratamiento con IL-12 in vivo disminuye la parasitemia y la mortalidad, y este efecto depende de la subsecuente activación de la producción de IFN-g y de TNF-a20.
Aún no se conoce claramente la regulación de la síntesis de IFN-g que desencadena una respuesta preponderantemente TH1 en la fase aguda de la infección. La producción de IFN-g podría ser el resultado de la activación de las células NK21, Thy-1+CD4-CD8- y, en menor medida, T CD4+ y CD8+.16 por la IL-12. La liberación de IFN-g sería la base de la protección ejercida en la infección por células NK y T CD8+.4, 22. La inhibición de la producción de IL-2, así como de la expresión de su receptor23, podría explicar la falta de evidencias claras sobre la producción de IFN-g por células T CD4+ en las etapas iniciales de la infección.
La respuesta TH1 que protege al huésped de la infección también podría estar relacionada con el daño tisular observado en la etapa aguda, ya que involucra, o se acompaña, de una activación generalizada de células inmunocompetentes y del incremento en la producción de mediadores inflamatorios, como IL-12 e IFN-g, que podrían estar implicados en el daño tisular24, 25, 26. En el huésped infectado con T. cruzi, la administración de IL-12 exacerba la reacción inflamatoria tisular, con el consecuente incremento de la mortalidad, mientras que ocurre el efecto inverso con la adminis-tración de anticuerpos anti-IL-1227. En la fase aguda de la infección se detectó la producción de IL-128, IL-629 y TNF-a30, citoquinas pro-inflamatorias que inducen en hígado la síntesis de proteínas de fase aguda31, y éstas se encuentran incrementadas en el suero, acompañando a los niveles altos de parasitemia29, 32. En la infección con T. cruzi, a semejanza de lo que ocurre en la mayoría de las infecciones, el TNF-a en bajas concentraciones actúa sinergísticamente con el IFN-g en la protección contra el parásito, mientras que si alcanza altos niveles actúa en detrimento del huésped, incrementando la reacción inflamatoria tisular8, 31. Esto se evidencia claramente en ratones transgénicos para el receptor soluble de TNF-a, donde la citoquina es neutralizada in vivo. En este modelo incrementa la susceptibilidad a la infección a pesar de la disminución de los infiltrados inflamatorios tisulares en el corazón33.
El control de la producción de IFN-g y de la respuesta TH1 en las etapas tardías de la infección podría deberse a la disminución de la estimulación de los macrófagos, como resultado de la declinación del número de parásitos, así como a la presencia de glucocorticoides, TGF-b, citoquinas TH2, como la IL-10, o bien al exceso de los mismos mediadores involucrados en la respuesta TH1, como el NO° y prostaglandinas.
Si bien en la etapa aguda predomina la respuesta TH1, también incrementan los niveles séricos de IgE34 y se observa la producción de citoquinas relacionadas con la respuesta TH2, como la IL-1035. Esta tendría un papel crítico como regulador del balance entre el efecto protector y la inducción del daño tisular de la respuesta TH1 en la infección con T. cruzi. La IL-10, aunque disminuye la protección conferida por el IFN-g, previene el desarrollo de la patología T-dependiente y la activación de células T CD4+ asociada a la sobreproducción de IFN-g e IL-1236.
A diferencia de lo observado en Leishmaniasis donde, en una misma cepa de ratones, la producción de IL-10 y de IFN-g se excluyen mutuamente37, 38, en la infección con T. cruzi no hay aun evidencias experimentales claras de que los parásitos infectivos puedan inducir en el huésped inmunocompetente una polarización tan marcada hacia una respuesta TH2, como en Leish-maniasis39, 40. Esto podría estar relacionado con la diferencia en la fuente de IFN-g e IL-10 en ambas infecciones. Tanto en los individuos normales como en los infectados con L. major, los principales productores del IFN-g y de IL-10 en el bazo son los linfocitos T CD4+.37. En cambio, en la infección con T. cruzi, el IFN-g proviene principalmente de células NK21, 39 y Thy+CD4-CD8-.16, mientras que la IL-10 es producida por macrófagos y por linfocitos B y T36, 39. La regulación de la respuesta TH1/TH2 ha sido estudiada en las poblaciones de linfocitos T CD4+, pero no se conoce claramente cómo se regulan cuando éstos no intervienen predominante-mente, como ocurre en la infección con T. cruzi. Las citoquinas TH2, que en Leishmaniasis estarían asociadas a la susceptibilidad38, podrían actuar como moduladoras de la respuesta TH1 en la infección con T. cruzi.
El TGF-b sería otro importante modulador de la respuesta TH1. En la infección con L. major, la producción temprana de TGF-b determina la susceptibilidad, ya que la IL-12 necesaria para la inducción de la respuesta TH1 se produce tanto en el huésped resistente como en el susceptible38. En cambio, en la infección con T. cruzi, las células productoras de TGF-b se encuentran en el bazo de ratones susceptibles y resistentes, tanto en la fase aguda como crónica de la infección41. Además, la administración in vivo de TGF-b incrementa la para-sitemia y la mortalidad que, a diferencia de lo que ocurre en Leishmaniasis, se observa tanto en ratones susceptibles como resistentes a la infección42.
In vivo, la IL-10 y el TGF-b podrían disminuir la activación de células fagocíticas, como reflejo de su capacidad inhibidora de la destrucción intracelular de T. cruzi in vitro en macrófagos activados6. De esta forma, a pesar de disminuir la destrucción del parásito, limitarían el daño tisular causado por los mediadores de macrófagos activados (Fig. 1).
Nosotros estudiamos la respuesta TH1 en ratones BALB/c y C3H inoculados con igual dosis de tripo-mastigotes sanguíneos de T. cruzi, cepa Tulahuén. Evaluamos los niveles séricos de IL-12 y de IFN-g, así como la producción de estas citoquinas y la actividad NK en células del bazo, que es el órgano linfático periférico que juega un importante papel en la eliminación de los parásitos44. En la fase aguda, los ratones BALB/c son más susceptibles (mayor mortalidad y parasitemia), mientras que los C3H tienen mayor susceptibilidad al daño tisular en la fase crónica de la infección45. Si bien la parasitemia no se detecta hasta el día 12 post-infección (pi), los parásitos llevan adelante su ciclo de multiplicación activa e invasión célula a célula desde los primeros días de la infección y su ARNm ha sido detectado en el bazo desde los 3 días pi15.

Respuesta no-adaptativa TH1 en el bazo de los ratones BALB/c y C3H

En el bazo de ambas cepas, la máxima producción espontánea de IL-12 ocurrió en la primera semana pi, acompañando a la activación policlonal temprana de la fase aguda46, y los niveles alcanzados fueron mayores en la cepa C3H que en la BALB/c (Fig. 2).También fueron altos los niveles de ARNm de IL-12 p40 encontrados en el bazo en un modelo experimental similar15. Al mismo tiempo aumentó la actividad NK, en forma proporcional a los niveles de IL-12 (Fig. 2). En este momento, la liberación espontánea de IFN-g sólo incrementó significativamente en la cepa C3H. Por su parte, las células del bazo de los BALB/c aumentaron la producción espontánea de IFN-g a las 2 semanas pi, coincidiendo con un segundo pico de actividad NK en esta cepa. En ambas cepas, cuando las células de bazo se estimularon in vitro con lipopolisacárido sólo hubo un cambio cuantitativo, pero no cualitativo, en el perfil de producción de IFN-g.47.
Los mecanismos que controlan la proliferación temprana del parásito, en la primera semana de la infección, son de importancia primaria en la resistencia del huésped48. En la infección con T. cruzi, el control inicial sería llevado a cabo por el IFN-g proveniente de células NK21. Los C3H, genéticamente con mayor actividad NK49, son mejores productores de IFN-g que los BALB/c en los momentos iniciales de la infección, y ésta podría ser la base de su mejor performance durante la fase aguda.
El papel central del IFN-g en el control de la infección con T. cruzi es de gran importancia en la fase muy temprana, antes de que se alcancen altas parasitemias. En esta etapa se pone en evidencia tanto el incremento de susceptibilidad por la administración de anticuerpos anti-IFN-g.21, 50, como la protección conferida por la administración de IFN-g exógeno51. Durante los primeros días se puede detectar la producción de IFN-g in vitro en las células del huésped por la presencia del ARNm o la producción de la proteína21, 35, 40, pero los niveles sistémicos son todavía insuficientes para detectarlo en suero.
El retardo en la producción de IFN-g en el bazo de los ratones BALB/c podría deberse a un nivel insuficiente de IL-12, a la ausencia de cofactores eventualmente necesarios para la respuesta (IL-15, IL-18, etc), a la producción temprana de citoquinas que controlan su producción (TGF-b, IL-4, IL-10, IL-13, etc), o bien a la baja actividad NK característica de esta cepa49. Todavía no fue dosada in vivo la actividad biológica de IL-12 en la infección con T. cruzi. Nosotros evaluamos los niveles de IL-12 p40, subunidad de la IL-12 incluida en la proteína p70 biológicamente activa, y se conoce que si la p40 es producida en exceso, podría inhibir a la p7052.
La respuesta podría requerir de otras citoquinas, como la IL-15 e IL-18. Estas citoquinas, al igual que la IL-12, son producidas por células fagocíticas y promueven la sobrevida y la producción de IFN-g en células NK, pero difieren de la IL-12 en su estructura y en el mecanismo de estimulación de la respuesta TH114, 15.
La IL-13 tiene una actividad biológica similar a la IL-453, pero no se ha determinado aun su papel en la infección con T. cruzi. En caso de ser producida, podría compensar la falta de IL-4 en la fase aguda de la infección, que no se encontró en el suero15, 54 ni en el sobrenadante de células de bazo, aun luego de la estimulación in vitro con antígenos del parásito40, 55.

Niveles séricos de IL-12 e IFN-g en los ratones infectados

Encontramos que los niveles de IL-12 p40 incrementaron muy tempranamente en el suero en ambas cepas (Fig. 3) y que se mantuvieron altos durante todo el curso de la infección. Las concentraciones de IL-12 alcanzadas son del orden de las encontradas cuando se inocula un superantígeno in vivo56. En ambas cepas, a pesar del rápido incremento de IL-12 p40, el IFN-g sérico recién aumentó a las 2 semanas de la infección; en este momento los BALB/c presentaron los niveles máximos de la citoquina, aproximadamente una semana antes del pico de parasitemia (Fig. 3). La disminución del IFN-g antes del pico de parasitemia también fue observado en otros modelos experimentales similares54, 55. En los C3H los niveles séricos de IFN-g fueron significativamente menores que en los BALB/c, con una cinética en forma de meseta de aproximadamente dos semanas.
Estos altos niveles séricos de IFN-g en las etapas tardías de la fase aguda no estarían relacionados con la resistencia a la infección, ni en nuestro caso ni en otros modelos experimentales16, 54. Sin embargo, este incremento de los niveles de IL-12 e IFN-g podría tener importantes consecuencias a nivel sistémico en el huésped infectado. El IFN-g es una citoquina pro-inflamatoria que induce la expresión de moléculas de Clase I y II del complejo principal de histocompatibilidad y de moléculas de adhesión intercelular en muchos tipos celulares, así como la activación de células fagocíticas, asociada a la liberación de mediadores potencialmente nocivos para el huésped31, como las especies reactivas del oxígeno57. Así, los altos niveles de IFN-g podrían contribuir a localizar infiltrados inflamatorios fuera de los órganos linfáticos periféricos, o bien a la activación de aquellos ya establecidos.
Los elevados niveles de NO° encontrados en la fase aguda, como resultado de la activación de la iNOS por el IFN-g, no parecen contribuir al daño tisular en la infección con T. cruzi, ya que el tratamiento con inhibidores específicos de la iNOS no afecta la extensión de los infiltrados inflamatorios en corazón y músculo58. Más aun, en ciertas condiciones, el NO° parece proteger de los efectos pro-inflamatorios del IFN-g.59.

IL-12 e IFN-g en la etapa crónica de la infección

En la etapa crónica, los niveles séricos de IL-12 p40 continuaron altos en ambas cepas, y fueron similares a los observados en la fase aguda (Fig. 3). Esto nos sorprendió, ya que actualmente se piensa que la IL-12 está relacionada con la respuesta inicial no-específica a las infecciones31. Sin embargo, como el parásito persiste de por vida en los tejidos de los ratones de ambas cepas, la presencia continua del estímulo parasitario podría explicar el mantenimiento de los altos niveles de IL-12 en la fase crónica.
Por otro lado, el IFN-g sérico sólo se halló alto en la cepa BALB/c (Fig. 3). En la cepa C3H, en cuyo suero no detectamos niveles importantes de IFN-g a pesar de la presencia de IL-12, tampoco observamos un incremento de la producción de IFN-g en las células del bazo con respecto a los controles, aun cuando éstas fueron estimuladas in vitro con Concanavalina A en presencia de IL-247. La casi ausencia de IFN-g en los C3H a pesar de los altos niveles de IL-12 indicaría claramente la necesidad de otros factores para inducir la producción de IFN-g. La inversa también parece cierta, ya que el IFN-g puede producirse independientemente de IL-1260. De modo que, si bien en los BALB/c hay tanto IL-12 como IFN-g, no puede afirmarse que haya una relación directa entre ellas.
Estas dos cepas de ratones tienen diferente susceptibilidad al desarrollo del daño tisular en la fase crónica. Esta etapa es relativamente benigna en la cepa BALB/c, pero la C3H desarrolla una importante miocardiopatía progresiva45. Los resultados, indirecta-mente sugieren la falta de una relación directa entre los niveles de IFN-g y el daño tisular en la fase crónica.

Consideraciones finales

Las concentraciones de citoquinas detectadas en diferentes niveles, como ser presencia de células productoras, expresión del ARNm, producción in vitro por células purificadas, espontánea o estimulada, y sus concentraciones séricas, estarían relacionadas con la capacidad de ejercer su actividad biológica. La respuesta inmune innata inicial a nivel de los órganos linfáticos periféricos, como el bazo y nódulos linfáticos, específica-mente preparados para comenzar la respuesta adaptativa del sistema inmune, estaría relacionada con el control de la infección en la fase aguda. Por otro lado, como para ejercer su función las citoquinas parecen necesitar una alta concentración local que se logra con su liberación localizada31, es posible que el daño tisular tenga mayor relación con aquellas citoquinas producidas por las células presentes en los infiltrados tisulares, cuyo perfil de producción puede diferir del observado en los órganos linfáticos periféricos61. De todos modos no puede descartarse que el efecto sistémico de los altos niveles séricos de citoquinas proinflamatorias pueda afectar directamente tanto a la respuesta en los órganos linfáticos como a los tejidos sensibles al daño, o bien potenciar el efecto de las citoquinas producidas en los infiltrados locales.
El papel de la respuesta inmune en la resistencia, dependería de la calidad y del balance a que llega la respuesta TH1, y podría ser evaluada en la etapa silenciosa, asintomática, que sigue inmediatamente a la infección. Mientras que en la fase florida, de incremento de parasitemia, donde los niveles de citoquinas TH1 son tan altos que pueden detectarse en suero, el exceso de producción o bien su falta de control, podría estar relacionado con el daño tisular.
La infección con T. cruzi parece inducir una respuesta predominantemente TH1 con diferentes características según las bases genéticas de ambos, el huésped y el parásito. Si bien el eje IL-12/NK/IFN-g parece ser el principal protagonista, nuestros resultados sugieren que ésta es la parte visible del iceberg de la respuesta TH1, y que sus moduladores, no todos conocidos, tienen un papel muy importante para determinar la expresión de una amplia gama de respuestas protectoras TH1 y de modularlas para controlar el daño tisular.

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Fig. 1.– Diagrama que indica en forma aproximada los nive- les en los cuales actúan la IL-1b43, el TGF-b42, la IL-1021, el TNF-a8 y el GM-CSF9 en la regulación de la respuesta inmune en la etapa aguda de la infección.
Fig. 2.– Incremento (expresado en veces sobre el control no infectado) de la producción de IL-12 p40 y de IFN-g, así como de la actividad NK en el bazo de ratones BALB/c y C3H en dos tiempos de la fase aguda de la infección. Para las citoquinas, se indican los valores basales o con estimulación con lipopolisacárido (LPS) . * Las diferencias con el control son estadísticamente significativas (p < 0.05, t de Student).
Fig. 3.– Incremento (expresado en veces sobre el control no infectado) de los niveles séricos de IL-12 p40 y de IFN-g en ratones BALB/c y C3H en la fase aguda y crónica de la infección. * Las diferencias con el control son estadísticamente significativas (p < 0.05, t de Student).