JUAN JOSE CAZZULO*

Instituto de Investigaciones Biotecnológicas, Universidad Nacional de General San Martín, San Martín, Provincia de Buenos Aires

*Miembro de la Carrera del Investigador del CONICET (Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas)

Palabras clave: Trypanosoma cruzi, cysteine proteinase, cruzipain

Resumen

La cruzipaína es la cisteína proteinasa principal del parásito causante de la enfermedad de Chagas, Trypanosoma cruzi. La enzima está codificada por un número grande de genes (hasta 130 en la cepa Tul 2) dispuestos en tandem cabeza-cola, y ubicados en dos a cuatro cromosomas diferenes, según el clon o cepa del parásito. La expresión simultánea de varios genes diferentes lleva a la producción de una mezcla compleja de isoformas. Las isoformas englobadas en el término «cruzipaína 1» difieren esencialmente en el dominio C-terminal, en su secuencia de aminoácidos y en su patrón de N-glicosilación. Se ha determinado la presencia de una forma que difiere más marcadamente, particularmente en la región catalítica, la cruzipaína 2.

Abstract

Cruzipain, major cysteine proteinase of Trypanosoma cruzi: sequence and genomic organization of the codifying genes. Cruzipain is the major cysteine proteinase present in Trypanosoma cruzi, the parasite causing the American Trypanosomiasis, Chagas disease. The enzyme is encoded by a high number of genes (up to 130 in the Tul 2 stock) placed in head-to-tail tandems, and located in two to four chromosomes. The simultaneous expression of several different genes results in the production of a complex mixture of isoforms. Those known as a group as «cruzipain 1» differ essentially at the level of the C-terminal domain, in their aminoacid sequence and in their type of N-glycosylation. The existence of a more distantly related cysteine proteinase, «cruzipain 2», has been demonstrated; it differs markedly, particularly at the level of the catalytic moiety.

Dirección postal: Dr. Juan José Cazzulo, Instituto de Investigaciones Biotecnológicas, Universidad Nacional de General San Martín. INTI, Edificio 24. Av. Gral. Paz entre Constituyentes y Albarellos, Casilla de Correo 30, 1650 San Martín, Prov. de Buenos Aires, Argentina. Fax: (54-11) 4752-9639 E-mail: jcazzulo@iib.unsam.edu.ar

Todas las células eucarióticas poseen un conjunto de actividades de peptidasas, incluyendo tanto endopep-tidasas o proteinasas, como exopeptidasas1. Sus funciones son muchas, y van desde la digestión de proteínas endocitadas con fines nutricionales, hasta el procesado de proteínas a través de una proteólisis limitada y muy específica, que lleva a la producción de las proteínas funcionales maduras. En el caso de las células de mamífero, la variedad de actividades proteolíticas presentes es apreciablemente mayor que la que se encuentra en células de eucariotes inferiores, y en éstas es, a su vez, mayor que la presente en procariotes. La universalidad de estas enzimas se observa en el hecho de que aún ciertos virus poseen proteinasas específicas, que les sirven para el procesamiento de la poliproteína en que se expresa primariamente el genoma viral1.
El Trypanosoma cruzi, parásito causante de la enfermedad de Chagas, es un flagelado perteneciente al Orden Kinetoplastida. Como en otros miembros de la familia Trypanosomatidae, se encuentran proteinasas pertenecientes a cuatro de las clases principales, a saber cisteína proteinasas, que son las más abundantes, serina proteinasas, metaloproteinasas y treonina proteinasas (el proteasoma)2. Las cisteína proteinasas informadas hasta el presente corresponden esencialmente al Tipo I según la clasificación de Coombs y Mottram3, que se caracteriza por presentar una extensión C-terminal, si bien recientemente se ha clonado el gen que codifica una catepsina de tipo B, correspondiente al Tipo III4.
La cruzipaína5, 6 es una cisteína proteinasa lisosomal (aunque hay también localización de algunas isoformas minoritarias en la membrana plasmática7), presente en los epimastigotes a una concentración apreciablemente mayor que en los otros estadíos del parásito. Se trata de una glicoproteína del tipo de alta manosa, con un peso molecular aproximado de 41 kDa. La enzima está codificada por un número particularmente grande de genes (130 en la cepa Tul 2), colocados en serie y separados por espacios intergénicos de algo más de 400 pares de bases. Estas series (‘«tandems») se encuentran ubicadas, según la cepa o clon del parásito, en dos o cuatro cromosomas diferentes. El grupo de J. Scharfstein ha clonado un gen que codifica una cisteína proteinasa similar a la cruzipaína, y también perteneciente al Tipo I, pero con mayor divergencia a nivel de la parte catalítica; esta enzima ha sido denominada «cruzipaína 2»8. La Fig. 1 compara las secuencias de aminoácidos derivadas de ambos genes.
La cruzipaína se sintetiza como una proteína formada por cuatro partes bien diferenciadas (Fig. 1): un dominio pre (péptido señal) de 18 aminoácidos, que se pierde inmediatamente de la síntesis, al entrar la enzima naciente al retículo endoplásmico; un dominio pro- de 104 aminoácidos que, como en otras proteinasas, sería esencial para el plegamiento correcto de la enzima madura y la mantendría inhibida, hasta que se separa proteolíticamente, probablemente al activarse el lisosoma; una parte catalítica de 214 aminoácidos, altamente homóloga a las catepsinas S y L de mamífero y, en menor grado, a la papaína, formado a su vez por dos dominios que dejan entre ellos el surco corres-pondiente al sitio activo; y un dominio C-terminal de 130 aminoácidos, que caracteriza a las cisteína proteinasas de Tipo I de los trypanosomátidos. Este último presenta características estructurales notables, que incluyen la presencia de siete residuos de Thr modificados (las modificaciones post-traduccionales presentes son aún desconocidas) acompañados por siete residuos de Pro, entre los primeros 21 aminoácidos; ocho residuos de Cys, que parecen estar formando cuatro puentes disulfuro, en la zona central, y un extremo C-terminal que sobre 27 aminoácidos presenta 18 residuos hidrofílicos, 11 de ellos cargados (Fig. 2)5, 6. El único sitio potencial de N-glicosilación presente en el C-terminal, Asn 255, puede presentar, en diferentes moléculas, oligosacáridos de alta manosa, híbridos monoantenarios o complejos biantenarios5. Estudios muy recientes indican también la presencia de restos de ácido siálico y de oligosacáridos cortos unidos en O-glicosilación, en el dominio C-terminal (M Barboza, VG Duschak, JJ Cazzulo, A Couto y RM de Lederkremer, resultados no publicados). Recientemente hemos demostrado que el dominio C-terminal de la cruzipaína presenta, además, hetero-geneidades a nivel de su secuencia de aminoácidos5, 6. Las diferentes secuencias del C-terminal mostradas en la Fig. 3 fueron obtenidas a partir de cDNAs, lo cual hace altamente probable la expresión simultánea de un cierto número de genes diferentes en la forma epimastigote del parásito, de donde fueron aisladas9. Estas secuencias predicen proteínas con valores de pI que difieren en algo más de 1 unidad de pH. Este hecho, junto con la aparente falta de un puente disulfuro en algunas de las isoformas, sería la causa de diferencias estructurales, que re-sultarían en un diferente procesamiento del oligosacárido presente en Asn255. Estas variaciones en secuencia aminoacídica y en glicosilación del dominio C-terminal serían las principales responsables de la mezcla de isoformas que constituye la cruzipaína natural. En el caso de la cruzipaína 2, las mayores diferencias se encuen-tran, en cambio, a nivel de la parte catalítica de la molécula, y resultarían en la expresión de una cisteína proteinasa con diferente especificidad5, 8.
Hasta el presente no se han detectado genes de cruzipaína con un dominio C-terminal diferente que permita predecir la sustitución de su extremo por un ancla de glicosil fosfatidil inositol; es probable que las isoformas de membrana7 se encuentren ligadas de esa manera. Se ha demostrado, en cambio, que el último gen de un tandem clonado y secuenciado por el grupo de J. Kelly en Londres, presenta un dominio C-terminal más corto y completamente diferente en secuencia10. Este gen, sin embargo, parece no expresarse, como tampoco se expresa el último gen de un tandem de cisteína proteinasas del Tipo I clonado de Leishmania mexicana3.
La cruzipaína es un antígeno reconocido por sueros de pacientes chagásicos crónicos; la gran mayoría de los anticuerpos presentes en estos sueros están dirigidos contra el dominio C-terminal y no contra el dominio catalítico, y son capaces de inmunoprecipitar a la enzima sin inhibir a su actividad proteolítica, al menos usando sustratos cromogénicos pequeños5.
Las funciones de la cruzipaína no están aún completamente definidas, pero incluirían: 1) la digestión lisosomal de proteínas, exógenas o del propio parásito; 2) la protección contra la respuesta inmune del hospedador, por destrucción del fragmento Fc de las inmunoglobulinas ligadas a los respectivos antígenos, lo que dejaría el fragmento F(ab’)2, incapaz de activar el complemento y que actuaría así como protector; 3) un papel en la penetración del trypomastigote en la célula del mamífero, pues se sabe que inhibidores de protei-nasas inhiben parcialmente este proceso, 4) un papel en las etapas de diferenciación en diferentes puntos del ciclo de vida del parásito. Estudios recientes de varios laboratorios, empleando inhibidores de cisteína protei-nasas capaces de penetrar en el parásito11, 13, indican claramente una participación importante de estas enzimas, entre ellas presumiblemente la cruzipaína13, en estos procesos. Estos estudios abren la posibilidad de desarrollar inhibidores de la cruzipaína como drogas antichagásicas.

Agradecimientos: Los trabajos realizados se efectuaron gracias a subsidios de CONICET, SECYT, SAREC/Sida (Suecia) y TDR/WHO.

Bibliografía

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Fig. 1.– Comparación de las secuencias de aminoácidos derivadas de las secuencias de los genes que codifican a la cruzipaína 15 y a la cruzipaína 28. Las flechas indican los puntos de corte entre el péptido señal y el dominio pro-, entre el dominio pro- y la parte catalítica, y entre la parte catalítica y el dominio C-terminal. Se indican sólo los aminoácidos reemplazados en la cruzipaína 2 con respecto a la 1. Los puntos indican identidad.
Fig. 2.– Secuencia madura de la cruzipaína, indicando los sitios de modificación post-traduccional. Los sitios potenciales de N-glicosilación se indican con *; los restos de Thr modificados con #. Están subrayados dos grupos de seis residuos consecutivos, indicando los sitios de autoprocesamiento, y los quince restos de Cys, catorce de los cuales estarían formando siete puentes disulfuro. Las sustituciones de aminoácidos encontradas en diferentes isoformas de cruzipaína 1 se indican debajo de la secuencia principal.
Fig. 3.– Comparación de las secuencias del dominio C-terminal en ocho grupos de clones de cDNA9 con los clones originales cruzip 4 y cruzip 2 y C-terminal. Se indican en la parte inferior derecha el número de clones en cada grupo y los valores de punto isoeléctrico calculado para cada grupo en base a su composición en aminoácidos. Las refs. originales de cruzip 4 y 2 y de C-terminal son Åslund et al. (1991) y Campetella et al. (1992) en la ref. 5.