MODELOS EXPERIMENTALES PARA EL DESARROLLO DE NUEVAS HERRAMIENTAS TERAPEUTICAS
Coordinador: Dr. Edgardo Poskus

8a. Angiogénesis terapéutica con plásmido DNA de aFGF en cerdos conscientes con isquemia coronaria crónica. Alberto Crottogini.
Universidad Favaloro, Buenos Aires

La angiogénesis terapéutica utilizando genes que codifican determinados factores de crecimiento (FC) ha suscitado interés como alternativa para el tratamiento de la enfermedad ateroscle-rótica periférica y, más recientemente, de la enfermedad coronaria, especialmente para aquellos pacientes intratables con métodos convencionales. De los FC más estudiados, se destacan el VEGF (FC de endotelio vascular), bFGF (FC fibroblástico básico) y aFGF (FC fibroblástico ácido). La administración local de los genes que los codifican puede efectuarse mediante vectores (especialmente virales), o por inyección directa del plásmido en el tejido isquémico, lo cual reduce significativamente los costos del tratamiento. Hace un año estamos desarrollando un proyecto que contempla tres fases: 1) administración intramiocárdica directa de plásmido DNA de aFGF en cerdos con isquemia miocárdica crónica; 2) idem, pero con plásmido DNA de VEGF; 3) administración de plásmido DNA de VEGF en pacientes con enfermedad coronaria sintomática intratable. El modelo animal se logra ocluyendo progresivamente la arteria circunfleja mediante un oclusor Ameroid, y el efecto del tratamiento (4 mg de plásmido en 10 alícuotas) se evalúa midiendo, antes y a las 4 semanas de la inyección, la función sistólica regional (microcristales ultrasónicos de espesor parietal), la perfusión regional (SPECT-sestamibi con Tc99), la presencia anatómica de colaterales (cineangiografía) y el estudio histopatológico cualitativo y cuantitativo de vasos de neoformación. El proyecto se lleva a cabo en colaboración con el Servicio de Patología del Istituto Dermopatico dell’Immacolata (Roma, Italia) que efectuará los estudios experimentales y clínicos en isquemia periférica, y con Bio Sidus, S.A., a cargo de la producción del plásmido DNA de VEGF para uso humano.

9a. Desarrollos recientes en la construcción de vectores herpéticos defectivos. Alberto Epstein.
Centre de Génétique Moléculaire et Cellulaire. UMR 5534 – CNRS. Université Claude Bernard Lyon I – France

Uno de los logros recientes más espectaculares de la biología molecular es la posibilidad de introducir genes en un organismo, en una perspectiva profiláctica (vacunas a ADN) o terapéutica (terapias génicas). A fin de aumentar la eficacia de transducción del ADN es necesario utilizar vectores, los que pueden ser de tipo bioquímico (liposomas, lípidos catióni­cos) o biológico (vectores virales). En este contexto, los vectores derivados del virus herpes simplex de tipo 1 (HSV-1) presentan un interés particular debido a su neurotropismo y a la carga importante de ADN exógeno que son capaces de transportar. Los vectores herpéticos pueden ser atenuados o defectivos. A su vez, los vectores defectivos pueden ser de tipo recombinante o de tipo amplicón. Los vectores de tipo amplicón son absolutamente dependientes de la presencia de un virus herpético auxiliar para su producción, dado que no transportan genes virales. Estos vectores son completamente apatogénicos, a condición de que las preparaciones de vectores no estén contaminadas con particulas virales auxiliares citotó­xicas. En los últimos años se han desarrollado diferentes sistemas de producción de vectores amplicón que permiten obtener títulos relativemente altos de partículas vectores con un grado de contaminación extremadamente bajo. Estos sistemas se basan en la utilización de un conjunto de cósmidos, o de cromosomas artificiales de bacterias (BAC), que contienen la totalidad del genoma herpético auxiliar, salvo las señales de encapsidación, o bien en la utilización del sistema de recombi-nación específico de sitio Cre/loxP, que permite eliminar las señales de encapsidación del genoma viral (clonadas entre dos sitios loxP) en células que expresan la recombinasa Cre.

10a. Los inmunobiológicos recombinantes en Diabetes Mellitus Tipo 1: una herramienta para el diagnóstico y la terapia. Edgardo Poskus.
Cátedra de Inmunología, Facultad de Farmacia y Bioquí-mica, Universidad de Buenos Aires; Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral (CONICET-UBA)

La Diabetes Mellitus (DM) Tipo 1, o DM insulino-dependiente (DMID) es una enfermedad que aparece en individuos genéticamente susceptibles como consecuencia de la destrucción autoinmune progresiva de las células b pancreáticas mediada por linfocitos T (respuesta celular). Varios autoantígenos han sido implicados en el evento inicial que gatilla la autoinmunidad específica hacia la célula b. La enzima ácido glutámico decarboxilasa de la isoforma 65KDa (GAD65) es tal vez el principal autoantígeno involucrado desde el inicio en el fenómeno de pérdida de la tolerancia hacia los componentes celulares propios. La determinación de los autoanticuerpos específicos para la GAD65 (GADA; marcador capital de la respuesta humoral), por técnicas altamente sensibles de radioinmunoprecipitación, permite la detección precoz de la DM Tipo 1 subclínica con una antelación de hasta 10 años. Por otra parte, se ha establecido fehacientemente en modelos animales que la administración parenteral u oral del antígeno disparador (GAD65, o algunos de sus fragmentos) puede prevenir la enfermedad autoinmune por medio de la tolerización. Para todos esos estudios la proteína aplicada usualmente es la de origen recombinante, expresada en sistemas eucariotas con rendimiento relativamente bajo. Nuestro trabajo de investigación y desarrollo sobre la GAD65 ha conducido a la expresión con alto rendimiento de una variante de GAD65 en Escherichia coli, un sistema eucariota convencionalmente reconocido como inapropiado para sintetizar esa proteína nativa, por la tendencia a producir cuerpos de inclusión. La variante biosintética desarrollada es una quimera producida por la fusión de tioredoxina (12KDa) de E. coli y GAD65 humana (Trx-GAD). En otra etapa del trabajo se determinó que la Trx-GAD retenía completamente la actividad enzimática y la inmunorreactividad frente a los GADA de los pacientes con DM Tipo 1. Por ello, a partir de ese inmunobiológico recombinante artificial se pudo desarrollar un método alternativo no radiométrico para determinar los GADA, basado en el principio D-ELISA. La obtención de GAD65 escindida de la quimera, o de fragmentos moduladores de la tolerancia a partir de construcciones genéticas ad hoc, posibilitan que esta vía produzca no sólo el reactivo para el screening de la enfermedad sino los productos terapéuticos para su tratamiento preventivo precoz.