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SAIC TUMORES B 264. La vacunación con células de melanoma B16 irradiadas
genera anticuerpos específicos y disminuye el crecimiento tumoral en
ratones C57Bl. Laura Bover, Mariano Ochoa, Inés Bravo, Claudia
Kairiyama, Adriana Deganutti, José Mordoh El objetivo de este trabajo es evaluar la capacidad de células autólogas tratadas con interferon-alfa e irradiadas, de generar respuesta inmune específica y protección anti-tumoral, utilizando el modelo de melanoma murino B16/C57Bl. Se utilizaron células B16 libres de micoplasma tratadas con IFN-a (500 UI/ml) e irradiadas (50 Gy). 72 horas pre-vacunación se administró una única dosis i.p. de ciclofosfamida (0,45 mg/ratón). Las vacunas se administraron por vía s.c. los días 0, 7, 14, 21, y un refuerzo el día 35 (2 x 105 cél./dosis). Como adyuvante se utilizó QS21 (10µg /dosis). El día 42 se desafió a los animales vacunados (n = 4) y a un grupo control sin vacunar (n = 6) con un único inóculo s.c. de 1,3 x 104 células B16 viables. El volumen tumoral al día 66 fue signi-ficativamente menor en el grupo vacunado (0.53 cm3) que en el control (4.99 cm3) (Test Wilcoxon; p<0,05). En el 100% de los animales inmunizados, pero no en los controles, se detectaron títulos significativos (1/5000) de anticuerpos anti-melanoma por ELISA (Wil-coxon; p<0,05). Por Western-blot se detectaron bandas específicas de 102, 81, 67 y 48 kDa. Los tumores de los animales vacunados presentaron un importante infiltrado inflamatorio, no observado en los tumores del grupo control. Es posible concluir que: 1) la vacunación con células enteras irradiadas pretratadas con IFN-a induce la formación de anticuerpos específicos en el 100% de los animales vacunados; 2) dicha vacunación inhibe significa-tivamente el desarrollo del melanoma B16 en los animales tratados.
265. Producción de necrosis tumoral y efecto del GM-CSF en un
modelo de xenotransplante de melanoma humano en ratones «nude».
Silvina Gazzaniga*, Inés Bravo#, Romina Goldszmid*, Julio
Martinelli#, José Mordoh³, Rosa Wainstok* Se propuso disecar la respuesta inflamatoria producida por la necrosis tumoral y los efectos sobre la misma de la administración local de GM-CSF. Para ello, se transplantó subcutáneamente en ratones nude la línea de melanoma humano IIB-MEL-J. Una vez establecidos los tumores, se aplicó un spray de nitrógeno líquido (nliq) sobre la epidermis intacta por encima del tumor (día = 0). 18 de 35 ratones tratados recibieron GM-CSF intratumoral. Posteriormente, los animales se sacrificaron a los 2 o 15 días y se efectuó evaluación histológica. En los grupos tratados con nliq, el análisis reveló una necrosis significativa (77-100%) de la masa tumoral, un marcado edema peritumoral e infiltración celular de leucocitos polimorfonucleares (PMN) y macrófagos (M). Peritumoralmente, al d? 2, se registraron aumentos significativos (p< 0.001, test de Wilcoxon) en la infiltraci? de los grupos donde se provoc·la necrosis; siendo las medianas y los rangos: (PMN: 20 (2-150); M: 12 (3-150)) vs. control (PMN: 0 (0-5); M: 0 (0-9)). Estas diferencias se observan tambi? a los 15 d?s post-tratamiento. Intratumo-ralmente, al día 2, la abundancia de células infiltrantes aumenta con el tratamiento conjunto (PMN: 2 (0-34); M: 2 (0-37)) respecto al grupo control sin tratar (PMN: 0 (0-1); M: 0(0-2)) y al grupo tratado sólo con nliq (PMN: 0 (0-12); M: 0 (0-5)); diferencias que tienden a disminuir a los 15 días. Sólo se detectó crecimiento tumoral en los grupos que no recibieron tratamiento con nliq. Se concluye que, la necrosis por nliq del tejido tumoral incrementa la respuesta inflamatoria peritumoral, mientras que la infiltración intratumoral sólo aumenta por el tratamiento con nliq más GM-CSF.
266. Oligonucleótidos antisense potencian la apoptosis inducida
por idarubicina en la línea celular K-562. Luciano Vellón, Teresa
Cuello, Patricia Gargallo, Irene Larripa La línea celular K-562 derivada de un paciente con LMC en crisis blástica y portadora del rearreglo bcr/abl de tipo b3a2 es resistente a la apoptosis inducida por inhibidores de topoisomerasa II, como la droga idarubicina (IDA). Se trataron células de dicha línea con complejos de liposomas catiónicos (DMRIE-DOPE y Dcchol-DOPE) y oligonucleótidos antisense (ODNs AS) dirigidos contra el ARNm bcr/abl de tipo b3a2, y non sense (ODNs NS), en una razón 3:1 lípido/ADN, durante 72 horas, luego de lo cual se incubaron durante 24 horas más con idarubicina (IDA) ,0.5ug/ml, para inducir apoptosis. La misma se evaluó por observación morfológica al microscopio de fluorescencia. Las células tratadas con los conjugados DMRIE-DOPE y Dcchol/DOPE con el ODN AS específico para el rearreglo b3a2 mostraron un mayor porcentaje de apoptosis inducida por IDA (X ± DS: 14.74 ± 2.07 y 20.43 ± 4.58, respectivamente) comparadas con los controles no tratados con ODNs (X ± DS: 8.08 ± 0.82); (p<0.005). Los cultivos con ODN-NS no difieren significativamente de los controles. Los datos indican que los ODNs-AS dirigidos contra el ARNm bcr-abl de tipo b3a2 vuelven a las células de la línea K-562 sensibles a la IDA a la concentración mencionada.
267. Participación de IGF-1 en el desarrollo temprano de un
tumor ovárico experimental: correlatos hormonales. P. Hockl1, S.
Campo2, V.Lux-Lantos1 y C. Libertun1 El factor de crecimiento semejante a la insulina tipo 1 (IGF-1) es
una mol?ula ?timamente relacionada con el desarrollo ov?ico. Nuestro
objetivo consisti·en determinar si dicho factor estaba relacionado
con el crecimiento de un tumor experimental ov?ico (luteoma, L) a lo
largo de las 6 primeras semanas de su desarrollo. Dicho luteoma se
obtiene por autoinjerto de un ovario en el bazo de ratas
ovariectomizadas en estro, utilizando el ovario contralateral como
control (E). Las hormonas se midieron por RIA. Los resultados se
expresan como Media ± ES. La estadística se realizó con ANOVA. El
aumento del contenido de IGF-1 sigue un patrón semejante al del DNA,
salvo en la semana 3 donde se eleva bruscamente (ng/tumor, E: 27 ± 6
vs L: 124 ± 26, p<0,01). En cuanto a IGF-1 sérica, aumenta
también en la semana 3 (ng/ml, E: 5107 ± 219 vs L: 6774 ± 243,
p<0,01). Esto no se debe a un aumento de GH sérica, ya que la
misma no se eleva respecto del control a este tiempo (ng/ml, E: 15.8
± 1.3 vs L: 14.4 ± 2.2, n.s.). El contenido de IGF-1 sigue el mismo
perfil que el de inhibina A, previamente medida (pg/tumor, E: 2915 ±
300 vs L: 7906 ± 1380). A medida que prolifera el tumor aumenta
IGF-1. El aumento brusco del contenido de IGF-1 tumoral de la semana 3
estaría relacionado con el aumento de inhibina A. A su vez el IGF-1
sérico aumenta en la misma semana, sugiriendo una relación entre
ellas, y serían independientes de GH. 268. Buserelina: efecto sobre la proliferación celular de un
tumor experimental ovárico. A.Chamson-Reig, M. Bianchi, C. Libertun y
V. Lux-Lantos El desarrollo in vivo de un luteoma experimental es inhibido por buserelina (bus: agonista de GnRH) al suprimir LH y FSH. En trabajos previos describimos la presencia del receptor de GnRH en estos tumores, por lo que aquí investigamos un efecto directo del agonista sobre la proliferación de células del luteoma. Comparamos células de tumores de 6 semanas (TUM) con células de ovarios luteinizados (prepúberes con 25 UI PMSG, a las 48 h con 25 UI hCG y sacrificadas a los 5 días de hCG: SPO). Las células, obtenidas por colagenización, se incubaron 4 d en DMEM-F12-10% SFB (1.105/pocillo) y luego con bus (1 y 100 ng/ml) por 24, 48 ó 72 h. Durante las últimas 24 h se incubaron en DMEM-F12-0.1% BSA y 3H-Timidina (0.5 µCi/well). Se midieron IGF y progesterona (P) en el medio. La proliferación basal de TUM fue menor que la de SPO a todos los tiempos, p<0.01. Inc 3H-TIM (cpm): TUM: 24h: 2473 ± 451, 48h: 2512 ± 506; 72h: 3194 ± 664, constante a lo largo del tiempo; SPO: 24h: 3780 ± 627; 48h: 8636 ± 1828; 72h: 8663 ± 1258, se observó un pico a las 48 h, p<0.01. Bus, a ambas dosis, inhibió la proliferación sólo en SPO (p<0.05). IGF fue mayor en SPO que en TUM a todos los tiempos (IGF (ng/ml) SPO 24h: 4576 ± 210; 48h: 6160 ± 678; 72h: 6367 ± 171 vs TUM 24h: 2761.5 ± 670; 48h: 2512 ± 496; 72h: 3009 ± 559, p<0.01). P secretada por TUM aumentó a las 48h y fue siempre mayor que en SPO, donde no varió (p<0.01). En conclusión, las células tumorales proliferarían menos in vitro que las controles y serían insensibles a buserelina. Una baja tasa de proliferación estaría asociada a baja IGF y alta progesterona.
269. Expresión del RNA mensajero de subunidades de inhibina
durante el desarrollo de un luteoma experimental. Eleono-ra
Sorianello, Astrid Chamson-Reig, Victoria Lux-Lantos, Carlos Libertun Durante el desarrollo de luteomas experimentales en ratas los patrones de secreción de LH y FSH se encuentran disociados: LH aumenta inmediatamente al primer mes permaneciendo elevada hasta el mes 7, mientras que FSH recién aumenta al tercer mes, y cae a partir del mes 6. Esta regulación diferencial de FSH sugeriría la presencia de inhibinas secretadas por los tumores. Estudiamos la expresión de las distintas subunidades de RNA mensajero de inhibina por Northern blotting en los luteomas de 1, 3 y 7 meses de desarrollo (L1, L3 y L7) y en ovarios durante los distintos momentos del ciclo, expresando los resultados en función del RNA total obtenido por tejido. Se utilizó la expresión constitutiva de G3PDH como control. Se midieron FSH y LH séricas. Observamos que en el primer mes la subunidad bB se expresa en mayor medida que en el ovario en estro, a los tres meses los niveles caen y se recuperan parcialmente a los siete meses (RNA inhibina subunidad bB (UA): estro: 3.29 ± 0.41, L1: 12.64 ± 4.50, L3: 1.17 ± 0.75 y L7: 4.11 ± 2.99, p<0,01). Los valores de FSH (ng/ml) fueron: estro: 7.9 ± 0.9, L1: 9.9 ± 1.5, L3: 31.0 ± 4.4, L7: 13.6 ± 2.0, p<0,05. Existe una correlación negativa entre la subunidad bB y FSH en L1, L3 y L7 (Coeficiente de correlación: - 0,76, p<0,05). Estos datos indican que la expresión del mRNA de la subunidad bB varía en función del tiempo de desarrollo de los luteomas; existe además, una correlación negativa con los niveles séricos de FSH.
270. Expresión de receptores a2-adrenérgicos en células
tumorales mamarias humanas. Stella Vázquez, Alejandro Miadovan,
Alberto Baldi, Isabel Luthy Habíamos descripto que los compuestos a2-adrenérgicos estimulan significativamente la incorporación de Timidina tritiada en células tumorales mamarias humanas MCF-7 y en líneas del mismo origen desarrolladas en nuestro laboratorio (MH-4, MH-6 y MH-7). El objetivo del este trabajo fue analizar en estas mismas líneas la expresión y cuantificación de los diferentes subtipos de receptor a2-adrenérgico descriptos en otros tejidos humanos. Se estudió la expresión por RT-PCR con “primers” descriptos en la literatura y la cuantificación por unión de Rauwolscina tritiada a células en cultivo por ensayo de punto único a saturación. Tanto en las células MCF-7 como las líneas MH-6 y MH-7 se observó una banda identificatoria para los subtipos a2-C2 y a2-C4. No se evidenció en ninguna de estas líneas la presencia del subtipo a2-C10. La línea MH-4 mostró una total ausencia de expresión de receptores a2-adrenérgicos, aunque estas células proliferan al incubarlas con compuestos adrenérgicos. Una posible explicación para este hecho sería una eventual mutación del mismo. La unión de Rauwolscina tritiada (13 nM) a las células que resultaron positivas por RT-PCR fue la siguiente (MCF-7: 44,44 ± 2,67; MH-6: 31,29 ± 3,8; MH-7: 75,09 ± 6,78 fmol/106 c?ulas). Conclusi?: Se describe por primera vez la expresi? de receptores a2-adrenérgicos funcionales en células tumorales mamarias humanas.
271. Terapia génica con genes suicidas en modelos de
adeno-carcinomas murinos. Viviana Bumaschny, Armando Kara-ra, Gabriel
Fiszman, Cecilia Casais, Gabriela Sobrido, Gerardo Glikin, Liliana
Finocchiaro El propósito de este trabajo es explorar las posibilidades terapéuticas del sistema gen suicida / pro-droga en el tratamiento del cáncer, empleando DNA vehiculizado por liposomas catiónicos. Objetivos: a) desarrollar un sistema de transferencia genética in vitro e in vivo utilizando lípidos catiónicos; b) clonar el gen de la timidina kinasa del virus herpes simplex (HSV-TK) en un plásmido de alta expresión; c) transferir el gen suicida HSV-TK in vitro e in vivo a células de adenocarcinomas murinos de mama (M3) y pulmón (P07), determinando la dosis letal media de las mismas al ganciclovir (GCV); d) evaluar el crecimiento tumoral en ratones BALB/c portadores de M3 y P07 tratados con el sistema HSV-TK/ GCV. Métodos y resultados: Mediante el estudio in vitro, utilizando el gen de la b- galactosidasa, se determinó para todos los tipos celulares estudiados una mayor eficiencia de transferencia con la formulación DMRIE:DOPE y relaciones DNA:Lípido entre 1:6 y 1:15 ug/nmol (n=4). Las células neoplásicas transfectadas en forma transitoria con el gen de la HSV-TK resultaron ser entre 50 y 500 veces más sensibles al GCV que las células parentales (n=3). En experimentos por duplicado, grupos de 5 ratones BALB/c portadores de tumor M3 fueron inoculados con el plásmido conteniendo el gen de la HSV-TK por vía intratumoral. A los 20 días el grupo tratado i.p. con GCV mostró menor tamaño tumoral [(0.82±0.39) gr] que el grupo control inoculado con el vector sin inserto y salina [(2.50 ± 0.87) gr; p<0,05]. En dos experimentos, grupos de 5 ratones BALB/c fueron inoculados con células del tumor P07 transfectadas ex vivo con el gen de la HSV-TK. Mientras que los ratones inoculados i.p. con salina desarrollaron tumor al día 8, ninguno de los 5 ratones tratados i.p. con GCV desarrolló tumor al día 20 (p<0,01). Conclusiones: Se demostró que los tumores P07 y M3 pueden incorporar y expresar el gen HSV-TK con una eficiencia in vitro e in vivo suficiente para generar sensibilidad al GCV. Éste parece ser un buen modelo para el estudio de la terapia génica del cáncer con vectores no virales.
272. Efecto de la sobreexpresión de PKCg en células normales
de epitelio de mama. Esteban O. Mazzoni1, Elisa Bal de Kier Joffe1 y
Julio Aguirre-Ghiso1, 2 El fenotipo maligno depende en gran medida de alteraciones en las vías de señalización que regulan la expresión de diversas moléculas participantes en procesos de proliferación, adhesión, migración e invasión. La familia de enzimas PKC son serino-treonin quinasas, frecuentemente sobreexpresadas en tumores de mama, que además de participar en la vía mitogénica también regulan la expresión de proteasas extracelulares. Para estudiar si PKC está directamente involucrada en las primeras etapas de transformación tumoral, transfectamos con el gen de PKCg una línea celular normal de epitelio de mama (NMuMG). Mediante selección con G418 se obtuvieron dos líneas: NMuMG-PKC, que expresa la proteína PKCg y NMuMG-neo, línea control. Se analizaron los patrones de crecimiento de las líneas bajo distintas condiciones: sobre geles de colágeno la línea NMuMG-PKC no fue capaz de formar estructuras de tipo glandular similares a las ramificaciones mamarias, sobre una superficie plástica no apta para el cultivo la línea PKC sobrevivió formando mórulas mayores de 20 cel. y en agar blando formaron colonias (5,6 ± 1,2 vs 0,3 ± 0,4/campo). La línea NMuMG-PKC mostró además una menor capacidad migratoria sobre fibronectina (FN) (0,1 ± 0,08 vs 38,3 ± 10,5 mm) y una mayor organización del citoesqueleto con filamentos de actina mas evidentes. NMuMG-PKC presentó un aumento en la expresión de integrina g-1 (3,1vs1 UA) y de FN (2,5 vs 1 UA) que fue incorporada a la matriz extracelular en forma de fibrillas. Asimismo, se detectó un aumento en la actividad plasminolítica secretada (1,5 ± 0,5 vs 0,2 ± 0,06 UI/ml/mg) en la línea NMuMG-PKC. De acuerdo a estos resultados podemos concluir que la sobreexpresión de la enzima PKCg no sólo lleva a las células normales de epitelio de mama a mostrar diversas características compatibles con un fenotipo transformado, sino otros también sugieren desdiferenciación celular.
273. La expresión de glipican-3 modula la invasividad y la
diseminación metastásica de un adenocarcinoma mamario murino.
Eduardo Farías*, Lydia Puricelli*, Jorge Filmus#, Elisa Bal de Kier
Joffé* El glipican-3 (GPC3), un proteoglicano que se une a la membrana por un anclaje GPI, se expresa en el embrión pero no se detecta en la mayoría de los tejidos del adulto, excepto en la glándula mamaria y células mesoteliales. Se conoce que GPC3 participa en la regulación de la proliferación y sobrevida en algunos tipos celulares. Para analizar el rol de esta molécula en la progresión tumoral, la línea LM3, derivada de un tumor mamario murino que no expresa GPC3, fue transfectada en forma estable con el gen GPC3 de rata. Se estudiaron las características biológicas de dos clones LM3-GPC3 y dos clones control. Las células LM3-GPC3, que no difirieron de los controles en su morfología ni en su proliferación in vitro, fueron más susceptibles a la apoptosis inducida por deprivación de suero y mostraron menor adhesividad (1.6±0.4 vs 2.9 ± 0.9 DO/mm2, p<0.05), una demora en las primeras etapas del spreading (p<0.01) e inhibición de la migración (21% vs 51%, p<0.01). Asimismo, los clones LM3-GPC3 presentaron una inhibición del 80% en su capacidad para secretar uroquinasa (uPA) (p<0.01), pero respondieron mejor que los controles al tratamiento con TGFb2, con aumento de la producción de uPA. En cambio, TGFb2 no moduló la secreción de metalo-proteinasas en las células LM3-GPC3 pero indujo un aumento en los clones control. Todos los clones se inyectaron en ratones BALB/c. Si bien no se observaron diferencias en el crecimiento del tumor subcutáneo, los clones LM3-GPC3 mostraron menor invasividad local y desarrollaron un número menor de nódulos metastásicos en pulmón que los clones control, cuando se inocularon iv [Md: 113 (rango 26-200) vs 15.5 (6-57), p<0.01]. En este modelo de células tumorales mamarias, la re-expresión de GPC3 fue capaz de modular el comportamiento invasivo y metastásico.
274. Acido 5-Aminolevúlico y sus derivados en la TFD del
cáncer. Adriana Casas, Gabriela DiVenosa, Haydéee Fukuda, Alcira
Batlle La Terapia Fotodinámica (TFD) es un tratamiento para tumores que consiste en fotosensibilizar compuestos como las porfirinas endógenas sintetizadas a partir del precursor, el ácido 5-Aminolevúlico (ALA). Ciertos ésteres derivados del ALA por su mayor hidrofobicidad, se incorporarían mejor a las células e inducirían una mayor acumulación de porfirinas, logrando una TFD más efectiva. El objetivo del trabajo fue estudiar el efecto de estos compuestos sobre células de adenocarcinoma mamario murino (LM2, Htal.Roffo). Se incubaron (105 células/well) con distintas concentraciones de ALA o sus derivados y las porfirinas formadas se extrajeron y cuantificaron. La síntesis de porfirinas aumenta con el tiempo de incubación y la concentración de ALA, llegando a un plateau a las 6 hs, (máxima acumulación: ALA 0.6 mM). A 3hs de incubación la máxima cantidad de porfirinas acumuladas fue: ALA 0,6 mM: 46,9 ± 6,3ng/ 105cél, Hexil-ALA 0.01 mM: 60,0 ± 4,7ng/105cél; Metil-ALA 1,2 mM: 56,3 ± 3,2 ng /105cél; CDF-ALA 0.2mM: 19,1 ± 5,6ng/105cél. Se incubaron las células 3 hs en presencia de concentraciones equimolares (0.6 mM) de ALA o sus derivados, se irradiaron con distintas dosis lumínicas (0,04-5,5 J/cm2) y a las 21 hs se ensayó la viabilidad con MTT. El compuesto más efectivo a bajas dosis de irradiación fue el Hexil-ALA (0,04 J/cm2, 3% de viabilidad). El Metil-ALA fue el menos efectivo (0,2 J/cm2, 56% de viabilidad). La TFD a partir de ALA y sus derivados es efectiva en la línea celular LM2.
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