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SAIC TRANSPORTE 217. Caracterización y regulación por el citoesqueleto de
actina de un canal iónico permeable al sodio del riñón murino.
Marcelo Carattino1 2, Alicia Damiano1, Gustavo Timpanaro1, Orlando
Catanzaro2, Horacio Cantiello2, 3 El túbulo proximal del riñón es responsable del mayor porcentaje de reabsorción renal de sodio. Sin embargo, los canales permeables al sodio de esta región del nefrón no han sido previamente descriptos en detalle. El objetivo del presente trabajo fue determinar la presencia de canales iónicos apicales de corteza renal involucrados en el movimiento de sodio en condiciones normales y su regulación por el citoesqueleto de actina. Membranas celulares apicales de la corteza renal aisladas de ratones fueron obtenidas por precipitación con MgCl2 y centrifugación diferencial; y reconstituidas en un sistema de membranas lipídicas para la observación de canales iónicos. En 12 experimentos donde la actividad espontánea de canales iónicos no fue observada, la adición de una concentración polimerizante de G-actina (1 mg/ml), indujo y/o estimuló la actividad de canales permeables al sodio. En estas condiciones la activación por actina es transitoria, lo que es consistente con una inhibición del canal cuando los filamentos de actina alcanzan cierta longitud. Los canales presentaron una conductancia de 7-12 pS en presencia de un gradiente de sodio (en mM) de 200:20. La presencia de Apx, un canal epitelial regulado por actina que fue recientemente aislado del epitelio tubular renal de Xenopus laevis, fue también demostrada en membranas renales de ratón. La proteína mamífera equivalente al Apx anfibio tendría un peso molecular aparente de 105 kDa. En síntesis, este estudio determina la presencia de un canal iónico permeable al sodio cuya actividad estaría regulada por el citoesqueleto de actina en el nefrón murino. La posible asociación estructural entre un Apx mamífero y los canales observados requerirá futuros estudios.
218. Canales regulados por forskolina en células K562. Carlos
F. Kusnier, Horacio Cantiello, Basilio A. Kotsias La vía de la adenilato-ciclasa es una candidata como factor
regulatorio de las corrientes iónicas dada su amplia distribución en
las membranas. El objetivo de este trabajo es estudiar la probable
regulación de las corrientes iónicas por esta vía en la línea
celular K-562 perteneciente a una leucemia mieloide humana crónica.
Por patch-clamp se registraron canales en las configuraciones de
parche unido a la célula (cell attached) y con el parche escindido
(inside out). En condiciones basales (140 mM de NaCl en baño y
pipeta) los preparaciones fueron silentes y la introducción de
forskolina 40 µM, activador de la adenilato ciclasa indujo la
actividad iónica, como se verá un canal permeable al Cl- . En 6
células se midió la actividad de este canal en la configuración “cell
attached” e “inside out”. Para comprobar la selectividad al Cl-
se hizo el inside-out reemplazando el Na+ del baño por
N-metil-D-glucamina comprobándose similar actividad del canal. Esto
implica que el Na+ no permea a través del canal. Se obtuvieron curvas
corriente-voltaje y se calculó la conductancia del canal. En la
configuración cell attached la conductancia fué de 40 pSiemens y en
inside out de 54 pS ya que la conductancia suele ser mayor cuando
existe la misma concentración del ión permeable en ambos lados de la
membrana. Tal es el caso del Cl- en la configuración inside out.
Además se observó un mayor conductancia cuando el Cl- penetra en la
célula que cuando sale: rectificación saliente. 219. Expresión de canales iónicos y no iónicos en
sinciciotrofoblasto de placenta humana a término. Alicia Damiano1, 2,
Silvia González Perret 2, Marcelo Carattino2, Horacio Cantiello2,
Basilio Kotsias3, Cristina Ibarra1 El sinciciotrofoblasto de placenta humana a término carece de uniones estrechas y el transporte de metabolitos, iones, y agua entre la sangre materna y fetal se realiza exclusivamente por la vía transcelular. Nuestro propósito es comenzar a identificar los canales iónicos y no iónicos implicados en la función de transporte. Para ello se purificó el ARN total, y mediante la técnica de RT-PCR usando primers que flanquean zonas de nucleótidos altamente conservadas se amplificaron secuencias que codifican para el regulador del transporte de la fibrosis qu?tica (CFTR) y para canales de agua (AQPs). Los productos de amplificaci? se analizaron por electroforesis horizontal en geles de agarosa y los resultados obtenidos muestran que en sinciciotrofoblasto se expresa una banda esperada de ~ 295 bp correspondiente al exon 13 del CFTR y otra banda de ~ 400 bp correspondiente a la zona NPA-NPA de las AQPs. Los estudios de Western blot se realizaron sobre una fracci? de membranas apicales de sinciciotro-foblasto utilizando dos anticuerpos monoclonales específicos para el CFTR humano, uno dirigido contra el dominio R y el otro contra el dominio C-terminal. En ambos casos se detectó una banda de ~170 kDa, que corresponde a la forma glicosilada de la proteína completa informada en otros tejidos humanos. En la misma preparación se observó una importante banda de ~160 kDa usando un anticuerpo policlonal dirigido contra un fragmento de la proteína apical de células epiteliales de túbulo renal de Xenopus laevis (Apx), la cual se informó que estaba asociada a un canal de sodio sensible a amiloride. Resta dilucidar la importancia fisiológica de la presencia de canales de Cl-, Na+ y agua identificados por biología molecular en el sinciciotrofoblasto de placenta humana a término.
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