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SAIC ENDOCRINOLOGIA C Coordinadores: R. Cabrera, J Tezón 220. Identificación de una nueva mutación en el gen de la
tiroglobulina humana y su asociación a un nuevo marcador
microsatélite. Carina Rivolta, Fernando Mendivel, Christian Moya,
Héctor Targovnik El bocio hereditario frecuentemente resulta de cambios
estructurales y funcionales en la proteína tiroglobulina (Tg) que
alteran la síntesis de T4 y T3. Estos cambios surgen de mutaciones
exónicas e intrónicas en el gen de la Tg y el modo de herencia es
autosómico recesivo. Se ha identificado en un individuo con bocio
congénito una deleción en el ARNm del gen de la Tg de 138 bases
entre las posiciones 5549 y 5686 correspondiendo al exón 30. Con el
fin de determinar la causa de dicha deleción se estudió el grupo
familiar y el análisis de secuenciamiento del ADN genómico reveló
en los dos hermanos afectados una transversión G®T en el sitio +1
donante de splicing del intrón 30. Además se ha identificado una
secuencia del tipo STR (Short Tandem Repeat) polimórfica en el
intrón 29 a 73 bases del comienzo del exón 30.Amplificando el ADN
genómico por PCR y visualizando los productos mediante electroforesis
en gel de poliacrilamida desnaturalizante se determinó que ambos
hermanos enfermos portan el mismo alelo del marcador microsatélite
por lo cual se podría establecer una asociación entre el
polimorfismo y el defecto de tiroglobulina. El marcador microsatétite
descripto será útil para el asesoramiento genético de familias que
padecen distintas patologías tiroideas siendo éste un método
rápido y confiable. 221. Generación de un inhibidor soluble por cultivos celulares
en monocapa. León Krawiec, Paula Aphalo, Hebe Durán, Lucía
Policastro, Mónica Palmieri, Mario Pisarev, Guillermo Juvenal, Laura
Bocanera. Los cultivos tiroideos en monocapa, producen un inhibidor citosólico de la tiroperoxidasa (TPO), que explica su pérdida de capacidad de organificar yodo días antes de la desaparición de la actividad de (TPO). Este inhibidor está ausente en tejido fresco y en folículos en suspensión. No posee especificidad tisular ya que los cultivos primarios en monocapa de macrófagos y la línea establecida 3T3 de fibroblastos lo producen con actividades inhibitorias de TPO del 94 y 50 % respectivamente. La presencia del inhibidor de TPO en un tejido que no la posee, supone su acción sobre más de un camino metabólico. Siendo máximo el tenor del inhibidor en el cultivo en confluencia, lo relacionamos con la inhibición por contacto, lo que supondría la inexistencia del inhibidor en cultivos tumorales. Sin embargo, las líneas epiteliales tumorales PDV y PDV/C57 transformadas quimicamente”in vitro” manifestaron capacidades inhibitorias de 70 y 73% respectivamente y un cultivo primario de adenoma tiroideo inhibió 46%. Por el contrario tumores epiteliales producidos químicamente ”in vivo” en ratones Sencar no poseían inhibidor citosólico, asemejándose a lo observado en piel y tiroides normales frescas. La generación de un tumor epitelial, en ratones “nude”, por inoculación de células transformadas en placa, permite la aparición del inhibidor citosólico «in vivo». Esto supone que el pasaje celular por el estado de anclaje a la placa, produce la mutación responsable de la aparición del inhibidor. La mutación se mantiene luego del transplante celular al animal vivo.
222. Acción del cinc sobre la termogénesis de la grasa parda.
Angel Zaninovich, Ines Rebagliati, Marcela Raices, Adriana Weisstaub,
Conrado Ricci, Karl Hagmüller. El cinc (Zn) es un componente esencial de muchas enzimas que regulan los procesos metabólicos. En dosis suprafisiológicas tiene efectos tóxicos. Este metal inhibe la conversión de tiroxina (T4) a triiodotironina (T3) en la grasa parda y esa acción podría afectar la producción de termogenina en este tejido. Se estudiaron ratas Wistar de 300 g de peso fueron hechas hipotiroideas por la injección i.p. de 131I. Luego se injectaron a cada animal 300 ng (dosis de reemplazo) o 1500 ng de T3/100 g de peso/dia, s.c. por 2 dias, en dosis divididas y se las colocó en cámara fría a 4°C. A la mitad de cada grupo se le injectó, además, sulfato de Zn 10 mg/kg de peso/dia, i.p., durante 2 días. Se dió muerte al animal, se extrajo la grasa parda interescapular y se aisló la mitocondria para medir la unión del guanosin difosfato (GDP) a las proteinas mitocondriales. Se estudiaron 5 ratas por grupo. En ratas normales sin tratamientos, la unión del GDP fué de 537 ± 61 (DS) pmol/mg proteina. El Zn redujo el binding a 186 ± 48 pmol/mg proteina (P<0.01). En ratas con dosis fisiológicas de T3, la unión del GDP fué de 273 ± 17 pmol/mg protein y en las que recibieron Zn se redujo a 127 ± 39 pmol/mg protein (P<0.01). En ratas tratadas con dosis altas de T3, la unión del GDP aumentó a 410 ± 10 pmol/mg protein, y se redujo a 140 ± 14 pmol/mg proteina luego de injectar Zn (P<0.01). Los resultados sugieren que el Zn deprime la calorigénesis en la grasa parda por un mecanismo no relacionado con el bloqueo de la conversion de T4 a T3.
223. Acción del óxido nítrico sobre la peroxidasa tiroidea.
Valeria Grossoni, Francisco Schöpfer, León Krawiec, María Carreras,
Juan Poderoso, Laura Bocanera La síntesis de las hormonas tiroideas se realiza en dos etapas: 1) organificación del yodo, 2) acoplamiento de las tirosinas iodadas. Es catalizada por la tiroperoxidasa (TPO), en presencia de tiroglobulina, yodo y H2O2. Trabajos previos demuestran que el óxido nítrico (NO), inhibe la organificación. El objetivo de este trabajo fue verificar si dicho efecto se produce por inhibición de la TPO. Para ello se utilizó TPO de membranas tiroideas bovinas, extraídas con Tritón 0.1%, durante 3 hs y la actividad enzimática se determinó por incorporación de 125 I a tirosinas. Tratamientos de la TPO con concentraciones crecientes de NO (10-50 µM), producen una inhibición máxima del 58% Esta inhibición sería consecuencia de la unión del NO al grupo hemo de la enzima, lo que provocaría un desplazamiento del pico de absorción de 411 a 403 nm (especie inactiva). Se estudió si la inhibición enzimática era reversible, comprobándose que lo era, luego de 7 minutos (C: 84470 (cpm 125I/ 0.1 mg prot) ± 5260, TPO con NO: 62128±5008, TPO sin NO: 80411± 3576). Sin embargo el pico de absorción no revirtió a 411 nm, pasando a 401 nm. Para ver si además de un efecto directo del NO existía otro indirecto, mediado por peroxinitrito, producido por la unión del NO y el anión superóxido, se incubó TPO con distintas concentraciones de peroxinitrito (150-600 µM), observándose una inhibición máxima del 50%. De estos resultados podemos concluír que el NO inhibe la actividad de la TPO de un modo directo y reversible por unión al grupo hemo e indirecto a través de la acción del peroxinitrito.
224. Efecto de la nicotinamida en la accion del 131I sobre la
tiroides. Marcos Agote, Guillermo Juvenal, Leon Krawiec, Laura
Bocanera, Erica Kreimann, Alejandra Dagrosa, Mario Pisarev El 131I se usa en el tratamiento del hipertiroidismo y del cáncer diferenciado de tiroides, pero las dosis empleadas implican un peligro para las personas en contacto con el paciente. Para lograr el mismo efecto terapéutico con dosis menores de radioyodo se estudió el efecto radiosensibilizante de la nicotinamida en ratas normales y bociosas (por la administración de metilmercapto imidazol, durante 15 días) de 120 gr de peso corporal (PC). Los animales recibieron dosis variables (25-500 µCi) de 131I con y sin nicotinamida. Luego de un mes los animales fueron sacrificados y se determin·la relaci? peso tiroideo/PC. Se determin·la ADP-ribosilaci? de prote?as en homogenatos de tiroides incubados con 3H-NAD, as·como el flujo sangu?eo luego de la inyecci? de 86Rb. Resultados: la nicotinamida no alteró per se el peso tiroideo. Tanto las ratas normales como las bociosas mostraron una progresiva disminución de PT/PC con dosis crecientes de 131I y esta acción fue significativamente magnificada por la acción de la nicotinamida (p<0.01). Este fármaco no alteró la ADP-ribosilación pero aumentó 100% el flujo sanguíneo tiroideo (p<0.05). Conclusiones: la nicotinamida tiene un significativo efecto radiosensibilizante sobre la tiroides sometida a dosis terapéuticas de radioyodo y esta acción se debe a un aumento de la oxigenación tisular. Estos resultados abren la posibilidad de su uso terapéutico en seres humanos. Subsidios de CONICET, SECYT y UBA.
225. Niveles de Cortisol, Estradiol y Progesterona en monas
Cebus prepúberes y adultas: efectos del estrés y tratamien-to con
dexametasona. Mónica Lahoz, Margarita Porta, Carlos Nagle, Marta
Torres, Armando Mendizábal Para evaluar los efectos del estrés y tratamiento con dexame-tasona (DEX) sobre los niveles de estradiol (E) y progesterona (P), en relación a cortisol (C), monas Cebus prepúberes, <3años (PP) y adultas, >5años (A), fueron divididas en: I- PP (n=3), A (n=5) bajo estrés por inmovilización, sedación (Ketalar 10 mg / Kg) y venipuntura femoral repetidas a tiempo 0, 1, 2, 4 y 24 hs. II- PP (n=3), A (n=5) idem I, más DEX i.m. 2mg/Kg a tiempo 0. Se dosó C, E y P por RIA. A tiempo 0, el C de PP y A fue alrededor de 80 ug/100ml. El estrés produjo un aumento sostenido de C mayor en PP, 4hs: 295 ± 71 vs A, 4hs:117 ± 13 ug/100 ml en A) . En PP, E (53 ± 12 pg/ml) y P (5 ± 1 ng/ml) fueron menores que en A (E: 300 ± 50 pg/ml y P: 57 ± 12 ng/ml) y no se modificaron bajo estrés, excepto por un aumento temporal de P en A luego de la 1ª maniobra. DEX suprimió el C en PP y en A a un 3% de los valores basales y al 1,5 y 4% respectivamente de los valores medidos bajo estrés. DEX no modificó E. En PP la P disminuyó de 3.6 ± 0.8 a 0.4 ± 0.1 ng/ml a las 24 hs de DEX. En A, P aumentó de 77 ± 8 a 138 ± 42 ng/ml a la hora, para retornar a valores basales a las 24 hs. Conclusión: la mona Cebus presenta altos niveles de esteroides desde la prepubertad sin perder su capacidad de respuesta al estrés, con incremento de C. La P prepuberal, suprimida por DEX al igual que C, sugiere un origen exclusivamente adrenal de P, a diferencia de las monas adultas.
226. Supersensibilidad al stress en ratas (ifl nu)
genética-mente hipoprolactinémicas en varios modelos experimentales
en comparación con ratas wistar. Yanina Cisella, Gabriela Pulenta,
Gabriel Vía y Graciela Jahn Las ratas IFL Nu son hipoprolactin?icas y alop?icas, con lactancia deficiente y alteraciones en el eje dopamin?gico. Estudiamos el efecto del stress en ratas IFL Nu o Wistar macho y en hembras en los 4 d?s del ciclo, el d? 19 de pre?z (G19), y OVX mas estr?eno (Eg, 2 ?g) y/o progesterona (Pg, 5 mg x 2) para evaluar el impacto de los distintos ambientes hormonales sobre la sensibilidad al stress. El stress se provocó por traslado a una sala contigua al bioterio, exposición al éter por 2 min. y sangría por la vena de la cola (S1) y una segúnda sangria 5 min despues (S2). Se midió PRL, progesterona (Pg) y GH por RIA. Hubo grandes diferencias en la respuesta al stress en ambas cepas según el modelo estudiado. En ratas Wistar el S1 aumentó PRL solamente en proestro (P; co: 7 ± 2; S1: 48 ± 9) y en diestro 2 (D2; co: 4 ± 1; S1: 15±5), mientras que el S2 siempre elevó PRL (P S2: 26 ± 5; E, co: 13 ± 5; S2: 42 ± 12; D1 co: 11 ± 3; S2: 53±16; D2, S2: 12 ± 3; macho co: 12 ± 3, S2: 26 ± 4), salvo en G19 y en OVX+Pg y OVX+EgPg. En las ratas IFL Nu la PRL aumentó en SI y S2 en todos los dias del ciclo, con niveles de PRL siempre mayores que las Wistar y hubo respuesta en G19 y en OVX+EgPg. El stress no modificó GH en las ratas Wistar, mientras que esta cayó en las IFL Nu en P, estro, D2 y OVX. Las ratas Wistar tuvieron Pg mas alta y respuesta menor al stress que las IFL Nu. En conclusión, las ratas IFL Nu son mucho mas sensibles al stress que las Wistar. Las variaciones observadas entre los dias del ciclo, la gestación y las respuestas al Eg y la Pg indican un rol modulador para el Eg e inhibitorio para la Pg de la respuesta al stress en ambas cepas.
227. Niveles sericos comparativos de prolactina en el
tratamiento prolongado con los antagonistas D2-5HTA2 Risperidona y
Clozapina, en pacientes esquizofrénicos hospitalizados. Norberto
Zelaschi, Juana Rodriguez, Sergio Gaitán, Sergio Panizzo, Azucena
Sobrero, Angelica López, Fernando Archuby Objetivos: Presentar nuevas evidencias sobre el efecto hiper- prolactinémico sostenido causado por el antagonista D2-5HTA2 Risperidona (Ris) comparado con su similar Clozapina (Cz) y un grupo de comparación (GC). Método: Se estudió un grupo de 20 pacientes, 11 tratados con Ris y 9 con Cz, presentando diagnóstico de esquizofrenia – Criterio DSM IV – ; se incluyó un GC formado por 19 controles sanos. Se realizaron 3 extracciones de sangre por venipunción, en ayunas a las 8 AM, con frecuencia quincenal a cada uno de los paciente luego de un año de tratamiento con dosis constante. La Prolactina (Prl) fue dosada en suero por radioinmunoensayo. Resultados: Las edades para los grupos Ris, Cz y GC fueron: X ± SD =56 ± 11.98, 41 ± 6.92 y 25±4.50 respectivamente. Se realizó el test de ANOVA con variables homogéneas utilizando log10 de los valores obtenidos y comparaciones múltiples con el método de Tukey. ANOVA: F=26.65, p=000000; Tukey: GC (17.33 ± 4.33 ng/ml) vs Ris (33.03 ± 15.92 ng/ml) p=0.001031, GC vs Cz (10.22 ± 2.32 ng/ml) p=0.007800, Cz vs Ris p=0.000125. Conclusiones: Ris posee en la administración crónica claros efectos hiperprolactinémicos, contrariamente a lo observado con la Cz. El potente antagonismo preferencial sobre los receptores D2 de la Ris es una plausible explicación de la discrepancia neuroendócrina hallada entre ambos antipsicóticos atípicos, los que exhiben un similar perfil farmacodinámico.
228. Efectos del fotoperíodo sobre la población lactotropa en
golden hamster macho. Gloria Cónsole1, Susana Jurado1, Ricardo
Calandra2, 3, Karina Zitta3, Fernando Riccillo1, Celia Ferese1, César
Gómez Dumm1 Las gonadotrofinas y la prolactina cumplen un importante rol en el mantenimiento de la función gonadal normal en hamsters. En el presente estudio se investiga el efecto de la privación de luz sobre la población lactotropa adenohipofisaria. Grupos de 5 hamsters machos fueron mantenidos desde el nacimiento en fotoperíodos largos (FL: 14hs luz, 10hs oscuridad) o expuestos a fotoperíodos cortos (FC: 6hs luz, 18hs oscuridad) durante 8, 16, 22 y 28 semanas. Las hipófisis se procesaron para microscopía de luz. Los cortes histológicos se inmunomarcaron mediante anti-PRL-EnVision (Dako)-DAB. Se registraron los parámetros estereológicos por medio de un analizador de imágenes (Optimas). La densidad de volumen (DVx10-2) y la densidad de células (DCx10-4) presentaron descenso significativo (p<0.01) en los grupos FC de 8, 16 , 22 y 28 semanas respecto a los FL. PRL FL FC
229. Cambios morfológicos en adenohipófisis de monos
desnutridos. Susana Jurado1, Gloria Cónsole2, Evelia Oyhe-nart3,
Celia Ferese2, Héctor Pucciarelli3, César Gómez Dumm2 La desnutrición (dieta hipoproteica) determina una marcada reducción de la actividad hipofisaria y afecta la función de los órganos blanco. El presente trabajo investiga los cambios inmunohis-toquímicos cuantitativos y ultraestructurales de las diferentes poblaciones adenohipofisarias en monos malnutridos. Se utilizaron 12 monos Saimiri sciureus (6 machos y 6 hembras), bajo dieta ad libitum 20% proteínas: controles y 10% proteínas: grupo experimental (2 años). Se procesaron las hipófisis para microscopía de luz y electrónica. Se inmunomarcó con anti-GH,-PRL,-LH,-FSH,-ACTH,-TSH -EnVision-DAB. Se determinó la densidad de volumen (DV) y la densidad de células (DC) en un analizador de imágenes. DV *p<0.05 CONTROLES malNUTRIDOS
230. Alteraciones endócrinas en ratones deficientes de receptor
dopaminérgico D2 (RD2). Graciela Díaz de Torga, Claudia Feierstein,
Diego Gelman, Malcolm Low, Marcelo Rubinstein, Carlos Libertun y
Damasia Becú de Villalobos El RD2 en la hip?isis anterior regula la secreci? de prolactina (PRL) en forma inhibitoria. Usando ratones knockout para RD2 estudiamos la regulaci? del crecimiento, los niveles s?icos de PRL e IGF-I, y de la liberaci? de PRL por angiotensinaII in vitro. Se determinaron PRL e IGF I séricos a los 2, 4, 6 y 8 meses de edad en hembras (H) y machos (M) knockout (-/-), wildtype (+/+) y heterocigotas (±). Los ratones -/-, H y M, desarrollaron hiperprolactinemia ya a partir de los 2 meses de edad (172.1 ± 19.0 y 101.3 ± 22.0 en H -/- y +/+; y 157.0+33.8 y 61.2 ± 11.1 ng PRL/ml en M -/- y +/+, p<0.05 para ambos sexos). La prolactinemia aumentó hacia los 8 meses sólo en las H-/-. El peso corporal de H y M -/- fue menor que aquel de los +/+ ó ± a partir de los 4 meses de edad. En forma correlativa los niveles séricos de IGF fueron inferiores en ratones -/- a los 2, 4 y 6 meses (2 meses: H 2068 ± 270 y 2756 ± 202 ng/ml, para -/- y +/+ p<0.05). A los 8 meses de edad los animales se sacrificaron, y las hipófisis se procesaron para cultivo celular. Las H-/- presentaron un tumor hipofisario. La liberación de PRL por angiotensina II (10 nM) in vitro, fue menor en H y M -/-, y, en todos los casos inferior en H. Concluimos que en ratones deficientes del receptor D2 está alterada la regulación tanto de PRL como de IGF-I, y que una diferente sensibilidad a secretagogos en los lactotropos D2-/- podría participar en la hiperprolactinemia e hiperplasia del modelo experimental. 231. La Leptina inhibe la secreción de Progesterona en cultivos
de trofoblasto humano. Paula Cameo, Paul Bischof, Juan Carlos Calvo Durante el embarazo, la concentración de leptina, una proteína producida por adipocitos, se encuentra elevada en suero. Recientemente se mostró que la placenta humana produce leptina, pero todavía se desconoce el papel y su regulación en este órgano. Usando cultivos puros de células de trofoblasto, hemos medido la producción de progesterona en condiciones basales y después del agregado de distintas concentraciones de leptina recombinante humana (rhlep). Células del citotrofoblasto (CTB) fueron aisladas a partir de placentas normales a término (36-42 semanas). Por digestión con tripsina y un gradiente discontinuo de Percoll, se separaron de las células sanguíneas y del sincicio. Posteriormente se inmunopurificaron con anticuerpos (anti CD45) acoplados a partículas magnéticas. Las CTB se incubaron por duplicado en DMEM en presencia (para la obtención de sinciciotrofoblasto, STB) o ausencia de SFB y/o rhlep (1-2000 ng/ml). Se midió progesterona por RIA (sensibilidad: 0.02 ng/ml). Los resultados se expresaron como valores por mg de proteína ± SEM. El análisis estadístico se realizó por anova. A los 2 días de cultivo la rhlep (1 µg/ml y 2 µg/ml) inhibe significativamente la liberación de progesterona al medio en presencia (1 mg/ml: p<0.05) o ausencia (p< 0.01, p< 0.001) de SFB 10%. A los 4 días de cultivo la secreción de progesterona también disminuyó en ambas condiciones (p<0.01; p<0.05). Conclusiones: Nuestros resultados son la primera evidencia de inhibición de la secreción de progesterona por leptina en placenta humana.
232. 21 deoxialdosterona, precursor para la síntesis
extradrenal de aldosterona? Daniela Rogoff1, Mark Foecking2,Celso
Gomez-Sanchez2 La Aldosterona (A) se sintetiza principalmente a partir del colesterol a través de DOC. Una vía alternativa que involucra la 21 deoxialdosterona (21deoA) ha sido demostrada en tejido adrenal humano y de algunos animales. En algunas circunstancias (déficit de 21 hidroxilasa (21HO) e hiperaldosteronismo primario) la excreción urinaria de este metabolito está elevada. Ante las evidencias de actividad 21HO en tejido extradrenal, quisimos evaluar la posibilidad de conversión extradrenal de 21 deoA a A. Se estudiaron queratinocitos humanos (células HaCaT).La expresión del gen CYPc21 fue evaluada por RT-PCR. La presencia de actividad 21 HO fue evaluada incubando las células con proges-terona marcada(P4) y midiendo la producción de DOC. La conversión de 21deoA a A fue valorada incubando las células con 21deoA marcada y midiendo la A formada después de extracción y separación por TLC. La 21deoA fue sintetizada a partir de A por incubación con Eubacterium lentum. No se detectó expresión del gen CYPc21 en estas células. La P4 fue metabolizada extensamente. Sólo el 5-7% de P4 fue convertida a DOC. El 5-8% de la 21deoA fue transformada a A. Esta es la primera vez que se demuestra actividad 21HO en keratinocitos humanos adultos y que estos pueden convertir 21 deoA a A. La 21hidroxilación extradrenal de la 21deoA podría ser una fuente local o sistémica de un mineralocorticoide más potente y hasta ser el origen de aldosterona en aquellos pacientes con HSC por déficit de 21HO que recuperan la capacidad retentora de sal.
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