ANALISIS DE PROGENITORES HEMOPOYETICOS EN MUESTRAS DE MEDULA OSEA Y DE SANGRE PERIFERICA EN PERIODOS VARIABLES DE CRIOPRESERVACION

CATALINA C. BIANCHI de DI RISIO, MIGUEL ANGEL SORRENTINO, HECTOR O. LONGONI, PATRICIA G. LUCHETTA, CLAUDIO D. DUFOUR, ANIBAL J. ROBINSON

Instituto de Investigaciones Hematológicas, Academia Nacional de Medicina; Servicio de Hematología, Hospital Naval Dr. Pedro Mallo, Buenos Aires

Key words: cryopreservation, hemopoiesis, bone marrow transplant

Resumen

Con el objeto de evaluar, en función del tiempo, los efectos de la criopreservación sobre los proge- nitores hematopoyéticos, se estudiaron muestras de médula ósea (MO) y células progenitoras de sangre periférica (SCP) de pacientes sometidos a trasplante autólogo. Se midió la viabilidad celular y utilizando cultivos de progenitores CFU-GM y BFU-E, el poder clonogénico de las mismas y para evaluar si el estroma medular estaba afectado, se utilizó el cultivo a largo térmico (CALT). De los 23 pacientes estudiados, 5 tenían LMA, 7 MM, 6 LNH, 3 LLA y 2 LH. De estos recibieron trasplante de MO autóloga 9 y 14 de SCP. El tiempo de congelación, previo al transplante, varió entre 24 y 33 días, mientras que los cultivos fueron efectuados entre 16 y 40 meses posteriores a la congelación. El desarrollo in vitro de colonias fue positivo en el 40% de las muestras de LMA y MM, en cambio, en el resto de las muestras, tal desarrollo se observó en casi el 100%. En las enfermedades linfoides hubo buena correlación entre las células CD34+ y el número de colonias desarrolladas in vitro, no así en LMA y MM. Esto hizo suponer que la enfermedad previa fuese la causante del bajo desarrollo in vitro. En los CALT la capa adherente tuvo su mejor desarrollo con células provenientes de MO, en cambio con las de SCP solamente se observaron macrófagos y fibroblastos. Por lo tanto se desprende que la eficiencia de la criopreservación puede ser medida empleando cultivos de progenitores CFU-GM y BFU-E y que el período que las muestras permanecen congeladas no afecta la potencialidad clonogénica de las mismas.

Abstract

Analysis of hemopoietic progenitor cells in bone marrow and peripheral blood samples which have undergone different periods of cryopreservation. Bone marrow (BM) and peripheral blood stem cell (PBSC) samples from patients undergoing autologous transplant were tested to evaluate the effects of cryopreservation. Cell viability was assessed as well as the proliferative capability of CFU-GM and BFU-E (myeloid and erythroid progenitors respectively). Moreover, long term culture (LTC) of stromal cells was used to test their functionality. A total of 23 samples were studied: 5 from AML patients, 7 MM, 6 NHL, 3 ALL and 2 HL. Nine patients received autologous bone marrow transplant (ABMT) and the remaining 14 PBSC. The cells were frozen during 24 to 33 days before infusion and 16 to 40 months before culture. Forty percent of AML and MM samples gave rise to colonies in vitro while the other hematology diseases tested showed colony growth in almost 100% of the cases. Samples from patients with lymphoid diseases exhibited a good correlation between the percentage of CD34+ cells and the number of colonies developed in culture. Nevertheless, there was no correlation when ALL and MM were tested suggesting that the underlying disease may have affected the growth in culture. The stromal layer was fully developed on BM samples, but on PBSC samples it only generated macrophages and fibroblasts. Our results suggest that the efficacy of cryopreservation of hematopoietic cells can be measured by means of CFU-GM and BFU-E culture and that the period the samples remained frozen did not affect the growth capability of the cells.

Dirección postal: Dra. Catalina C.B. de Di Risio, Suipacha 612, 1008 Buenos Aires, Argentina. Fax: (54-11) 4332-0753 E-mail: FaustoDR@bancaria.com.ar

Recibido: 6-I-1999 Aceptado: 16-VI-1999

El transplante autólogo de médula ósea es una práctica médica cada vez más empleada con objetivo terapéutico para malignidades hematológicas y tumores extrahematológicos.
La finalidad del transplante es lograr restablecer una actividad medular normal a través de la reinfusión de precursores hematopoyéticos sanos, utilizando médula ósea autóloga o heteróloga o progenitores extraídos de sangre periférica, con un procedimiento directo o previamente criopreservada.
Una criopreservación es eficiente cuando logra conservar inalteradas las características biológicas, físicas y fisiológicas de las células progenitoras hematopoyé-ticas1.
Los factores de mayor significación para evaluar la eficacia del procedimiento de criopreservación son: el número de progenitores vivos y el estado de los componentes recuperados y la magnitud del daño causado a las células hemopoyéticas, considerando los tipos de tóxicos empleados, la temperatura adecuada, el tiempo de congelación y los efectos sobre la enfermedad de base de los pacientes.
Para examinar el poder clonogénico de los progenitores recuperados, una técnica adecuada es el cultivo en medio semisólido. Si bien el número de colonias obtenido en dicho cultivo, no puede ser considerado como totalmente representativo de la potencialidad de las células para poblar la médula ósea, esta técnica es posiblemente la única que hasta la fecha se posee para observar el eventual daño producido a los progenitores durante los procedimientos utilizados. En cuanto al tiempo de congelación, hay evidencias que muestran que el mismo no es factor limitante: en un trabajo se describe que los progenitores de 31 muestras de médula ósea no pierden su capacidad vital al permanecer congelados más de 48 meses2.
A pesar que el tiempo máximo durante el cual los progenitores mantienen inalteradas sus características hemopoyéticas no ha podido aún ser establecido con exactitud, en un trabajo reciente se demostró que los precursores hematopoyéticos, luego de 10 años de congelación, no perdieron su capacidad de formar colonias in vitro3.
Los procesos de proliferación y diferenciación de los precursores hemopoyéticos, dentro de la médula ósea (MO), necesitan la participación del estroma medular, que juega un papel importante en su regulación hematológica. Este microambiente medular está constituido por una población heterogénea de células, como: fibroblastos, células cargadas de grasa, células endoteliales, reticulares y macrófagos. En el trasplante se consideraba que era necesario infundir estos tipos de células en el receptor para que la recuperación hematológica se efectuara con mayor rapidez y eficiencia4.
Nuestro objetivo fue evaluar, en función del tiempo, los efectos de la criopreservación sobre los progenitores hematopoyéticos, midiendo su viabilidad y su poder clonogénico a través del cultivo en medio semisólido de unidades formadoras de colonias granulocito-macro-fágicas (CFU-GM) y unidades formadoras de colonias eritroides (BFU-E) y observar por medio del cultivo a largo término, si el estroma medular se encontraba preservado luego de las injurias recibidas en las muestras de médula ósea y de sangre periférica estudiadas.

Materiales y métodos

Criopreservación

Se estudiaron 23 muestras de pacientes (previo consentimiento informado de los mismos), con neoplasmas hematológicos, sometidos a trasplante autólogo utilizando médula ósea (MO) o bien células progenitoras movilizadas de sangre periférica (SCP) criopreservadas; las células fueron previamente acondicionadas en bolsas de polietileno de 500 ml y pequeñas alícuotas fueron colocadas en criotubos (Nunc, Inc. Naperville Il) de 2 ml de volumen, para poder ser utilizadas en ensayos posteriores. Las muestras se conservaron en nitrógeno líquido luego de un descenso de temperatura gradual en un congelador programado. Para ello fueron puestas en un equipo Cryomed con descenso gradual de temperatura, hasta -90°C, usando la microcomputadora programable modelo 1010 con tanque de congelación modelo 2.700. Las curvas de descenso se registraron con impresora modelo 6.100. El material se mantuvo a -190°C hasta su utilización en tanque Taylor-Wharton 27 K Cryostorage System5.

Descongelación

Fueron utilizadas muestras conservadas en los criotubos. Se extrajo una muestra del tanque de nitrógeno e inmediatamente se sumergió en baño a 37°C, agitando suavemente. Se esterilizó con alcohol etílico la superficie exterior del criotubo y se virtió el contenido en un tubo de centrífuga diluyendo 5 veces el volumen inicial con medio de cultivo, 10% SFB (suero fetal bovino) y 10 U de heparina, agregados gota a gota durante 5 minutos, centrifugando luego a velocidad moderada. Se lavaron una vez más las células y luego se suspendieron en medio de cultivo. Previo recuento se hizo control de viabilidad con azul-tripán6. Se procedió a cultivar las células en medio semisólido para obtener colonias y a cultivar a largo término.

Cultivo en medio semisólido

Las células obtenidas luego de la descongelación de las muestras se sembraron en cajas de Petri de 10 x 35 mm en razón de 200.000 células/ml, en presencia de 40 10-9 g/caja del factor estimulante: Pixy, (gentilmente donado pro el Dr. Messner, Toronto, Canadá) y 2 U/caja de eritropoyetina (Sidus, Argentina), en medio IMDM (Iscove Modified Dulbecco’s Medium), 30% SFB y 0.3% de Bacto agar (Difco); se colocaron luego en estufa a 37°C, en atmósfera saturada de humedad y CO2 al 5%.
A los 10 días se observaron los cultivos en microscopio invertido con aumento 20x y se contaron los agregados de células clasificándolos como colonias (mayores de 40 células) y explosión de muchas colonias eritroides cargadas de hemoglobina llamados «bursts»7-11.

Cultivo a largo término (CALT)

El CALT se efectuó utilizando medio Eagle’s Modified Medium, suplementado con 12.5% de SFB, 12.5% de suero de caballo y 106 molar de hidrocortisona (Sigma). En frasco de cultivo Corning de 25 cm2 se sembraron 2.106 células mononucleares/ml en un total de 5 ml. Se incubaron en estufa a 37°C, en atmósfera de CO2 al 5% durante 4 semanas, cambiando la mitad del medio cada 7 días, hasta obtener la confluencia de la monocapa12.

Resultados

En todos los pacientes trasplantados la actividad medular se restableció entre los 14 y 16 días; (se define actividad medular cuando los recuentos de neutrófilos superan los 500 por mm3 en tres tomas consecutivas y el número de plaquetas es mayor de 2000 por mm3, sin transfusiones).
En la Tabla 1 se reunieron los datos clínicos y de laboratorio de los 23 pacientes trasplantados. Los pacientes con LMA y LLA, cuando recibieron el trasplante se encontraban en remisión completa (RC). En LMA cuatro permanecían en RC a los 36 meses promedio, mientras 2 fallecieron, uno a los 12 meses por recaída de la enfermedad de base y otro a los 8 días del trasplante por síndrome hemorrágico. De los pacientes con LLA, 1 se encon-traba en RC a los 3 meses post-trasplante y 2 recayeron a los 5 y 6 meses del trasplante respectivamente.
Los pacientes con MM, LNH y LH, que antes del trasplante estaban en remisión parcial (RP), recibieron muestras cuyo tiempo de congelación varió entre 24 y 32 días.
Todos los pacientes con MM se encontraban a los 15 meses promedio post-trasplante en RP. De los pacientes con LNH, 5 estaban a los 16 meses promedio en RC y 1 paciente falleció a los 12 meses del trasplante. De los 2 pacientes con LH, uno vivía en RC a los 2 años del trasplante y el otro se encontraba afecto de HIV.
Para averiguar si el número de colonias in vitro podía estar alterado por causas relacionadas con el proceso de criopreservación se intentó verificar la existencia de una posible relación entre el número de células CD34 existentes antes de la congelación y el promedio de células muertas al descongelar la muestra. Como resultante de ello se confeccionó la Tabla 2. En LMA el promedio de colonias granulocito-macrofágicas (GM) fue bajo, siendo nulo para las colonias eritroides (E), si bien el porcentaje inicial de células CD34 fuera elevado. En MM se obtuvo también bajo desarrollo de colonias (GM) y (E), coincidiendo con un bajo promedio de CD34 y elevado promedio de células muertas. En el resto de las enfermedades el número de colonias GM y E fue elevado coincidiendo con el bajo promedio de células muertas a la descongelación.
En la Figura 1, donde se muestra el porcentaje de casos cuyas muestras alcanzaron algún desarrollo in vitro, se observó que en LMA y MM pocas muestras desarrollaron in vitro, mientras que en el resto de las enfermedades se registró un mayor número de casos que dieron colonias, alcanzando el 100% en LLA.
En la Tabla 3, donde se muestran los resultados obtenidos con los cultivos a largo término, observamos que, mientras en la mayoría de los casos donde fueron sembradas muestras de MO, las capas adherentes estuvieron conformadas por tipos de células (fibroblastos, macrófagos, células endoteliales, células cobertoras y de grasas), similares a lo que suele encontrarse en muestras normales, con los progenitores extraídos de sangre periférica, en la monocapa no se detectaron todos estos tipos celulares, observándose solamente macrófagos y fibroblastos en forma aislada y en escaso número.

Discusión

La criopreservación de las células hemopoyéticas se considera exitosa si se preservan inalteradas las propiedades biofísicas de las mismas13 y se evita el daño intrínseco producido por los tóxicos utilizados. Para determinar si la criopreservación ha sido eficaz es menester determinar la viabilidad celular luego de la descongelación y el poder clonogénico de los progenitores hemo-poyéticos.
En este trabajo nos propusimos observar la viabilidad celular luego de la descongelación y el número de colonias desarrolladas in vitro y evaluar además si el tiempo podría ser una variable significativa. Hubo muestras que luego de ser criopreservadas durante 40 meses, al ponerlas en el cultivo in vitro produjeron abundantes colonias, lo cual evidenció que el tiempo prolongado de congelación no había alterado su potencial hemopoyético. Sin embargo se observó que algunas enfermedades eran presuntamente limitativas para el desarrollo de colonias in vitro. Supusimos que el bajo rendimiento del desarrollo in vitro de las muestras de LMA y MM, podría deberse a que los progenitores estuviesen alterados en sus propiedades biológicas y físicas y que estas alteraciones persistirían aún durante la remisión clínica de los pacientes.
En las otras enfermedades linfoides, en cambio, dado que la serie linfática se encontraba afectada, los progenitores mieloides y eritroides no estarían intrínsecamente comprometidos y por lo tanto desarrollarían in vitro normalmente.
Por otro lado algunos autores postulan que el uso de criotubos, para que sea correcto, requiere una protección adecuada a fin de evitar el contacto con el nitrógeno líquido, puesto que dicho contacto por un largo período de tiempo, puede dañar al material criopreservado. En las bolsas de mayor volumen, el material estaría menos expuesto5.
En cuanto al cultivo a largo término, se observó en las muestras de MO que los componentes celulares del estroma medular estaban preservados luego de la congelación, mientras que de los movilizados de sangre periférica, las únicas células del estroma que proliferaron in vitro fueron los fibroblastos y los macrófagos que son células asociadas a los progenitores hematopoyéticos14.
Por lo tanto no es necesaria la presencia de células del microambiente medular para que el trasplante sea exitoso, dado que todos estos pacientes habían sido precedentemente trasplantados con óptimos resultados.
Los datos que aquí consignamos, no han podido ser comparados con otros de la bibliografía por no haber encontrado ningún trabajo que tratase este tema.
Podemos concluir que células progenitoras con muy alta capacidad proliferativa pueden ser conservadas en buen estado por largos períodos de tiempo, dependiendo su rendimiento de la enfermedad de base más que de la duración de la congelación.

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Fig. 1.- Porcentaje de muestras de médula ósea (MO) y de células progenitoras de sangre periférica (SCP) que dieron colonias in vitro
Las barras indican el porcentaje de casos de las distintas enfermedades, cuyas muestras alcanzaron algún desarrollo in vitro.

TABLA 1.– Datos clínicos y de laboratorio de los 23 pacientes trasplantados

Enfermedad Número Edad Estado Tipos de Tiempo de Tiempo de
hematológica de pacientes años previo al muestras congelación congel. previo
x- trasplante previo cultivo trasplante
meses días

LMA 5 33 RC 2:SCP 36 32
3: MO
LLA 3 22 RC 3:MO 35 33
MM 7 49 RP 7:SCP 16 26
LNH 6 40.5 RP 4:SCP 40 32
2:MO
LH 2 24 RP 1:MO 26 24
1:SCP

MO = médula ósea LMA = Leucemia mieloide aguda
SCP = células progenitoras periféricas LLA = Leucemia linfática aguda
RP = remisión parcial MM = Mieloma múltiple
RC = remisión completa LNH = Linfoma no Hodgkin
LH = Linfoma Hodgkin

TABLA 2.– Desarrollo in vitro de progenitores granulocito-macrofágicos y eritroides de las muestras descongeladas

Enfermedad Número Colonias x- CD34 Células muertas al
de casos GM E x- descongelar
x-

LMA 5 44 0 1.27 37
MM 7 9 33 0.15 42
LH 2 174 - 0.29 15
LNH 6 178 56 0.52 25
LLA 3 62 51 1.79 -

Colonias x- = promedio de colonias granulocítica-macrofágicas (GM) obtenidas luego de la descongelación
CD34 x- = promedio de células CD34 previo-congelación

TABLA 3.– Desarrollo del estroma medular en el cultivo a largo término de las muestras descongeladas de MO y SCP

Muestras Número Estroma medular
casos

MO 9 Capa bien desarrollada constituida por células de diferentes morfologías (fibroblastos,macrófagos, cél. reticu- lares, endoteliales, de grasa)
SCP 14 Macrófagos y fibroblastos exclusiva- mente

MO = médula ósea. SCP = progenitores extraídos de sangre periférica