JORGE H. MILONE, JAVIER BORDONE, ORLANDO ETCHEGOYEN, JUAN NAPAL, MARIA VIRGINIA PRATES, VICTOR H. MORALES

Instituto de Trasplante de Médula Osea (ITMO), Fundación Dr. José M. Mainetti, Gonnet, La Plata

* Premio Bernardino Rivadavia, Academia Nacional de Medicina de Buenos Aires, 1998

Key words: bone marrow transplantation, chronic myelogenous leukemia

Resumen

La Leucemia Mieloide Crónica (LMC) es un proceso oncohematológico caracterizado por una prolifera- ción clonal que afecta a la célula hematopoyética primitiva. Un 95% de pacientes presenta una alteración citogenética característica conocida como Cromosoma Philadelphia (Ph1), producto de una traslocación cromosómica 9: 22, que da lugar a un gen híbrido BCR/ABL. Diecinueve pacientes con LMC recibieron Trasplante Alogeneico de Médula Osea (TMO), 9 fueron de sexo femenino y 10 de sexo masculino. La media de edad fue de 32 años (rango 9-47); 15 de los pacientes estaban en fase crónica (FC) y 4 en fase acelerada (FA). Todos los pacientes al momento del diagnóstico fueron Ph1+, BCR/ABL+. El régimen de acondicionamiento consistió en Busulfán y Ciclofosfamida, con el agregado de Etoposido en los pacientes en FA. La profilaxis de EICH se efectuó con Ciclosporina A, Metotrexato y Metilprednisona en 17 pacientes y con las 2 primeras drogas en 2 pacientes. La traslocación 9:22 se estudió mediante técnica de RT-PCR, con empleo de las sondas NB1+, Abl3, B2A, CA3 y A2. La sensibilidad del método fue de 1 x 10-6. De 19 pacientes que ingresaron al protocolo, 14 permanecen vivos y en remisión clínica, hematológica y citogenética (Ph1 negativo); 3 pacientes fallecieron de EICH agudo, 1 de fallo de «engraftment» y 1 de síndrome urémico hemolítico. De 4 pacientes trasplantados en FA, 3 están vivos y en remisión completa. Los pacientes con LMC trasplantados presentaron una sobrevida del 74%, con un seguimiento medio de 655 días. El quimerismo hematopoyético completo se demostró en 16 pacientes, mediante el estudio de 3 loci, D1S80, APO B y D17S30. No se encontró ninguna relación entre la presencia post TMO del híbrido BCR/ABL (RT.PCR) y la recaída de la enfermedad; la presencia de EICH agudo y/o crónico no tuvo influencia sobre la positividad del BCR/ABL. El TMO ha demostrado ser en nuestra experiencia la única alternativa terapéutica para la LMC con obtención de remisión completa, clínica, hematológica y citogenética, con una sobrevida media del 74% comparable a la de centros internacionales de trasplante.

Abstract

Bone marrow transplantation in chronic myelogenous leukemia. Chronic Myelogenous Leukemia (CML) is an oncohematological disease characterized by a clonal proliferation concerning the primitive hematopoietic cell. A typical cytogenetic alteration known as Philadelphia Chromosome (Ph1), a 9:22 chromosomic translocation which produces a hybrid gene BCR/ABL, is present in 95% of the patients. Nineteen CML patients (9 female and 10 male) underwent Bone Marrow Transplantation (BMT). Median age was 32 years (range 9 to 47); 15 of them were in chronic phase (CP), and 4 in accelerated phase (AP). At diagnosis, all patients were Ph1+, BCR/ABL+. The conditioning regimen consisted of busulphan and cyclophosphamide while patients in AP received etoposide as well. Seventeen patients received ciclosporine A, methotrexate and methylprednisone as prophylaxis for Graft Versus Host Disease (GVHD) while 2 patients received only the first two drugs. The 9.22 translocation was determined by means of RT-PCT technique using the primers NB1+, Abl3, B2A, CA3 and A2. The sensitivity of the method was 1 x 10-6. Among the 19 patients who entered the protocol, 14 are alive and in clinical, hematological and cytogenetic remission (Ph1-) and 3 patients died due to acute GVHD, 1 due to graft failure and 1 due to Hemolytic Uremic Syndrome. Of the 4 transplanted patients in AP, 3 are alive and in complete remission. The patients had a 74% survival, with a median follow-up of 655 days. Complete hematopoietic chimerism was demonstrated in 16 patients, with the study of 3 loci, D1S80, APO B and D17S30. No relationship was found between post BMT hybrid BCR/ABL (RT.PCR) persistence and disease relapse; the presence of acute and/or chronic GVHD did not influence the BCR/ABL positivity. In our experience, BMT has proved to be the only therapeutic alternative for CML with complete clinical, hematological and cytogenetic remission and a mean survival of 74%, comparable to the international experience.

Dirección postal: Dr. Víctor H. Morales, Instituto de Trasplante de Médula Osea, Fundación Dr. José M. Mainetti, Calle 508 e/ 16 y 18, Gonnet, 1897 La Plata, Argentina
Fax: 54-021-71-4744; E-mail: itmo@netverk.com.ar

Recibido: 8-VII-1998 Aceptado: 9-XI-1998

La Leucemia Mieloide Crónica (LMC) es una hemopatía maligna, caracterizada por una proliferación clonal que afecta a la célula hematopoyética primitiva, involucrando a las líneas progenitoras mieloide, eritroide, mega-cariocítica, linfoide B y en ocasiones linfoide T1-4.
La enfermedad presenta diferentes fases: crónica (FC), acelerada (FA) y aguda (FAg), variando los porcentajes de mortalidad según el momento evolutivo. El 95% de los casos de LMC presenta una alteración citogenética característica conocida como cromosoma Philadelphia (Ph1). Este marcador citogenético de la enfermedad, identificado en 19605, fue la primera asociación demostrada entre una anormalidad cromosómica y una enfermedad maligna6. La existencia del Ph1 es el resultado de una traslocación recíproca de material genético entre los cromosomas 9 y 22: t (9; 22)-(q 34.1; q 11.21)7. A nivel del cromosoma 9 el punto de ruptura será el 34.1 y en el cromosoma 22 el punto 11.21 (breakpoint cluster region-bcr), traslocándose a esta región el gen abl procedente del cromosoma 9, y constituyendo el gen quimérico BCR/ABL8, 9 (Fig. 1).
El RNA mensajero (mRNA) transcripto por el gen de fusión es de 8.5 kb y codifica una proteína quimérica anormal de PM 210.000 daltons (p-210).
La terapéutica óptima para la LMC en FC es motivo de controversias. Entre los fármacos utilizados se destacan el Busulfan (Bu) y la Hidroxiurea(HIU) que si bien controlan hematológicamente la enfermedad no con- siguen remisiones citogenéticas ni tampoco curacio- nes10-12.
El Interferón (IFN) por su parte logra respuestas citogenéticas con 65% de metafases Ph1 negativas y con prolongación de la sobrevida. Desafortunadamente, sólo un bajo porcentaje de pacientes responde de esa manera, y son pocos los que alcanzan a nega-tivizarse citogenéticamente en su totalidad; aún en estos casos la traslocación bcr/abl es identificable con lo cual la curación de la enfermedad no se logra si definimos a la misma como el estado permanente de negatividad para Ph1 y para bcr/abl13-17.
En la actualidad el TMO es el único tratamiento que ha logrado un cambio en la historia natural de la enfermedad al lograr su remisión clínica, citogenética y molecular, logrando la curación al erradicar el clon leucémico. Los resultados del TMO en LMC van modificándose según la fase evolutiva de la enfermedad, consiguiendo entre un 60 a 80% de sobrevida a 5 años, si se efectúa en F.C.
Estos datos indican la necesidad de realizar TMO en LMC entre el primero y segundo año del diagnóstico.
El TMO es un procedimiento de altísima complejidad con una mortalidad relacionada al procedimiento elevada (± 20%) (Fallo de engraftment, Enfermedad Injerto vs. Huésped (EICH) Aguda, Enfermedad venooclusiva hepática, infecciones, etc.). Otra de las complicaciones es la recaída, la cual ocurre en un 10 al 20% en pacientes trasplantados en FC; la recaída de la enfermedad habla de la incapacidad del régimen acondicionante para eliminar el clon leucémico; lo ideal es lograr con la quimioterapia mieloblativa pre TMO la erradicación de todo el tejido medular funcional del paciente, facilitando así el «engraftment» de la célula progenitora del donante, logrando lo que se define como una quimera hematológica total o completa. (Tejido hematopoyético con característica genéticas totales del donante).
La persistencia de clones leucémicos post TMO, se conoce como Enfermedad Residual Mínima (ERM), siendo ésta una causa de las señaladas como responsable de la recaída de la enfermedad. En la actualidad mediante el empleo de técnicas de biología molecular de alta sensibilidad, mediante RT-PCR, se puede determinar a nivel molecular la presencia del mRNA transcripto quimérico (traslocación BCR-ABL), y su relación con la recaída de la LMC.
Objetivos: 1) Determinar en pacientes sometidos a TMO, afectados de LMC, la sobrevida actuarial y el grado de remisión clínica, hematológica y citogenética. 2) Analizar el grado de quimerismo total logrado post TMO con empleo de microsatélites (VNTR) y su relación con la recaída de la enfermedad. 3) Estudiar la presencia de ERM en pacientes con LMC y sometidos a TMO, mediante RT-PCR para la traslocación BCR-ABL, su evolución post TMO y eventual relación con la recaída de la enfermedad.

Material y métodos

Pacientes. Un grupo de 19 pacientes con diagnóstico de LMC que recibieron TMO entre los años 1994 y 1997, en el Instituto de Trasplante de Médula Osea (ITMO), Fundación Mainetti (La Plata), fueron incorporados a este protocolo. De ellos 15 fueron trasplantados en fase crónica y 4 en fase acelerada. Todos los pacientes presentaron al diagnóstico un estudio citogenético positivo, presencia del Ph1, y el RNAm híbrido BCR-ABL.
Los regímenes de acondicionamiento utilizados fueron: para los pacientes en fase crónica, Busulfan (Bu) 4 mg/kg/día durante 4 días y Ciclofosfamida (Cy) 60 mg/kg/día en 2 días consecutivos; para los trasplantados en fase acelerada al esquema anterior se agregó Etoposido (VP 16) 300 mgkg en dosis única. La profilaxis de Enfermedad Injerto vs Huésped (EICH) se realizó en los primeros 2 pacientes trasplantados con Ciclosporina, EV, (CsA) 3 mg/kg/día, y Metotrexato, EV, (MTX), 4 dosis, en día +1, 15 mg/m2, y en días +3, +6 y +11, 10 mg/m2; en los restantes 17 trasplantes al esquema anterior se agregó Metilprednisona (MP) 1 mg/kg a partir del día +15, con disminución de la dosis luego del día +120.
Las características clínicas pretrasplante de los pacientes pueden ser observados en la Tabla 1.
El trasplante se efectuó en todos los casos sin efectuar depleción de linfocitos T; 9 pacientes fueron de sexo femenino y 10 de sexo masculino. La media de edad fue de 32 años con un rango de 9 a 47 años.
Se realizaron los siguientes controles post TMO: estudio citogenético cada 6 meses y detección del grado de quimerismo y del mRNA leucémico BCR/ABL por PCR en 3 ocasiones con un intervalo de 6 meses.
Trasplante de Médula Osea. Todos los pacientes que recibieron TMO fueron internados en unidades de aislamiento con flujo de aire estéril. El día del trasplante se procedió a tomar médula ósea del donante.
El volumen medio colectado fue de 1.000 ml, y el volumen infundido fue de 202 ml (rango 73 a 570 ml). La media de células nucleadas totales fue de 3.10 x 108/kg (rango 2.03 a 4.78 x 108/kg) y de células mononucleadas de 1.85 x 108/kg (rango 1.02 a 2.96 x 108/kg).
La identificación de células progenitoras se efectuó mediante la determinación de células CD34 por citometría de flujo. Se infundió una media de células CD34+ de 2.83 x 106/kg (rango 0.80 a 6.95 x 106/kg).
En cuatro casos existió incompatibilidad eritrocitaria ABO mayor; donante A - receptor 0. En estos casos se procedió mediante el agregado de HES a sedimentar y eliminar los glóbulos rojos incompatibles, efectuándose la infusión en todos los casos sin ningún inconveniente para el receptor.
Estudio citogenético. Se efectuó con células de la médula ósea. Se empleó un método standard y bandeo G. Se analizaron 30 metafases. La sensibilidad del método fue del 5%.
Detección del RNAm híbrido BCR/ABL. Luego de producida la traslocación 9:22, durante la transcripción del DNA, el splicing del RNAm da como resultado a 2 productos alternativos que surgen de la unión del exón 2 o exón 3 del locus bcr con el exón 2 del locus ABL, formando el mensajero b2a2 o b3a2 respectivamente. Es decir que mediante la detección molecular del RNAm híbrido bcr-abl se determinarán las dos configuraciones exónicas.
Preparación del RNA. Se separaron las células mono-nucleadas de sangre periférica en gradiente de ficoll-hypaque. El RNA total fue extraído de acuerdo al método de Chomoczynski y Sacchi18. El RNA obtenido fue cuantificado mediante lectura en espectrofotómetro a OD 260 y OD 280.
Oligonucleótidos. Se utilizaron los primers NB1+, Abl3, B2A, CA3 y A2. (Fig. 2).
Amplificación por PCR. Se empleó la técnica de transcripción reversa y nested PCR en 2 etapas. En la 1ra Etapa se efectúa la retrotranscripción con empleo de la enzima transcriptasa reversa AMV obteniéndose cDNA; a continuación y en el mismo tubo con empleo de Tfl DNA polimerasa y de los primers NB1+ y Abl 3 se efectúa la primera amplificación. El volumen final de la reacción es de 50 µl y la mezcla de reacción está constituida por: primers NB1+ y Abl3 1 µM, SO4Mg 1 mM, dNTPs 0.2 mM buffer AMV-Tfl 1x(Promega) y RNA 1 µg. El esquema de la reacción fue: 94°C, 1 min; 48°C, 1 min. (Se agregaron las enzimas AMV transcriptasa reversa 0.1 µ/µl y Tfl DNA polimerasa 0.1 µ/µl); 48°C, 46 min; 94°C, 2 min; 35 ciclos de: 94°C, 1 min; 64°C, 1 min; 72°C, 1 min. Para finalizar 73°C, 10 min.
En la segunda etapa se realizan 2 amplificaciones: una destinada a detectar al gen genérico BCR/ABL y la otra para amplificar el gen ABL. Esta última se utiliza como control del material extraído y debe dar positivo para todas las reacciones.
Para cada muestra se colocarán 5 µl del producto de la primera etapa en cada tubo más 15 µl de la mezcla de reacción para efectuar la Nested-PCR. (vf: 20 µl). La mezcla de reacción empleada es la siguiente: 1 µM de cada primer (CA3 y B2A para BCR/ABL y A2 y CA3 para ABL), 0.2 mM de dNTPs, 2.5 mM CI2Mg, 0.5 µ/µl Taq. DNA polimerasa (Promega), PCR buffer 1 x constituido por TRIS-CIH (ph 9.0), 50 mM CIK y Triton-X 100 0.1%. La mezcla se colocó a 98°C, 20 seg; 35 ciclos a: 96°C, 1 min; 64°C, 1 min; 72°C, 1 min. La reacción finalizó a 73°C durante 10 minutos.
Como controles negativos se utilizaron células negativas para la traslocación BCR/ABL, en todos los procedimientos de extracción del RNA. Se empleó un control positivo, constituido por células K562. Se tomaron rigurosas medidas para evitar contaminación adoptándose las recomendaciones de Kwok y Higushi19.
Determinación de la sensibilidad del método. Se determina empleando células mononucleadas de la línea celular K562. Se detectó una célula K562 en 106 células normales (sensibilidad 1/106). (Fig. 3).
Evaluación de la amplificación. Se realizó mediante corrida electroforética (5 a 20 v/cm) 30 a 60 minutos, en gel agarosa (Metaphor MFC al 2%) teñida con Bromuro de Etilio (0.5 µg/ml). Se sembró 5 µl del producto obtenido. Se utilizó un control de pares de bases (bp) 100 bp Ladder Promega. En todas las muestras se debe obtener una banda correspondiente al gen abl de 275 bp (control del material extraído). En el caso de existir el transcripto quimérico b3a2 el producto poseía y mostraba una banda en 456 bp y si presentaba la configuración exónica b2a2 poseía y mostraba una banda 385 bp.
Los controles negativos no deben dar banda de amplificación y el control positivo (células K562) debe dar una banda de 456 bp.
Quimerismo. Para comprobar el grado de «engraftment» obtenido post TMO se estudiaron los VNTR (número variable en tandem repetitivos) en 16 pacientes. Los VNTRS son secuencias de DNA de 11 a 70 pares de base, altamente repe-titivas y en tandem que en un número variable se encuentran en diferentes individuos. Se estudiaron los siguientes loci: Locus D1S80: 16 bp; Locus APO B: 11-16 bp; Locus D17S30: 70 bp.
Extracción del DNA: se emplea el método salting-out modificado para pequeña escala (método rápido) a 500 µl de sangre periférica.
Amplificación del DNA: Se emplearon primers específicos para cada locus. La mezcla de la reacción consistió en: Buffer 1x Promega; Cl2Mg 1.5 mM; dNTPs 0.30 mM, Primers 77 pmol; ADN 0.5 a 1 µg tubo; Taq. Pol. 1 UI.
La determinación de VNTR se efectuó previo al TMO en el receptor y en el donante; posteriormente al receptor en forma simultánea a la determinación del ERM mediante RT-PCR para la traslocación 9:22 (ABL-BCR). Para la detección de VNTR se efectuó electroforesis en gel de agarosa Metaphor MFC al 2% teñido con bromuro de etidio 0.6 µg/ml. Se sembró 10 µl y se corrió a 70 v de 4 a 5 horas. Posteriormente se compararon los patrones del receptor (R) y del donante (D), pre y post TMO.

Resultados

Todos los pacientes que ingresaron al protocolo de estudio presentaron al diagnóstico el Ph1 y fueron positivos para el RNAm BCR/ABL por PCR. La frecuencia de la configuración exónica b3a2 fue del 68%, (13 pacientes) y el 32% restante fue b3a2/b2a2 (6 pacientes).
De los 19 pacientes ingresados, 14 de ellos están vivos, en remisión clínica, hematológica y citogenética (ausencia del Ph1) y 5 pacientes fallecieron siendo las causas: en un caso un síndrome urémico hemolítico (SUH) con fallo multiorgánico a los 4 meses (Pac. 3); un fallo de «engraftment» a los 2 meses (Pac. 17), y en tres casos EICH agudo, estadio IV histológico, a pesar de la profilaxis de EICH instituida, a los 8 y 5 meses (Pac. 18, 1 y 12 respectivamente). De los 4 pacientes trasplantados en FA, 3 están vivos con un seguimiento de 33, 29 y 23 meses (Pac. 6, 11, 13): el paciente que obitó lo hizo por un fallo de engraftment (Pac. 17). La sobrevida actuarial libre de enfermedad fue del 74% con un seguimiento medio de 655 días. (Fig. 4).
La presencia y evaluación de EICH se realizó teniendo en cuenta los criterios clínicos establecidos por el Grupo Cooperativo Europeo20.
El 89% de los pacientes presentó EICH agudo (16 pacientes sobre 18 evaluados), y el 71% EICH crónico (10 pacientes de 14 evaluados); 8 pacientes presentaron sólo EICH agudo, 2 pacientes sólo EICH crónico y 8 pacientes EICH agudo + EICH crónico. (Tabla 2).
Quimerismo. Empleo de VNTRs. El empleo de los VNTRs se utilizó para comprobar el grado de «engraftment» logrado post TMO. Sobre 16 pacientes estudiados en un 44% de los casos se pudo establecer la presencia de un quimerismo total mediante empleo de D1S80; cuando se utilizó D1S80 y APO B la frecuencia aumentó al 80%; el agregado de las determinaciones anteriores de D17S30 llevó el grado de determinación de quimerismo al 100% (Tabla 3).
Los resultados obtenidos en algunos pacientes pueden observarse en la Figura 5. Se pueden apreciar distintos pacientes, en los cuales se visualizan bandas del marcador en estudio, en el receptor (R) y en el donante (D) pre TMO y en el receptor (T), post TMO. En los casos mostrados desaparecen bandas en la muestra del receptor siendo reemplazadas post TMO por bandas presentes en la muestra del donante.
Investigación del Gen Quimérico BCR/ABL. El análisis molecular del gen quimérico BCR/ABL y de su producto amplificado efectuado en los pacientes en estudio post TMO se leyó en gel de agarosa pudiéndose apreciar en la Figura 6 a bandas de 456bp para la traslocación b3a2, y de 385bp para la traslocación b2a2.
En los 12 primeros meses de los 8 pacientes estudiados, 5 fueron PCR+ (62%). Entre los 12 y 24 meses se estudiaron para primera determinación 3 pacientes, siendo positiva una determinación (33%) y negativo el resto (66%). Entre los 24 y 36 meses post-TMO 6 pacientes fueron estudiados, de los cuales 4 fueron positivos (67%) y 2 negativos (33%).
El seguimiento en el tiempo post TMO y la reiteración del estudio de la traslocación, así como su relación con la presencia de EICH aguda y crónica se puede apreciar en la Figura 7.
Se pudo determinar que 3 pacientes habían negativizado la traslocación (pacientes 04-14-15), persistiendo la misma negativa en 3 y 2 realizaciones posteriores con intervalos de 6 meses entre cada una; 4 pacientes (25%) presentaron una positividad reiterada (pacientes 02-05-08-18), en tres oportunidades post TMO. De ellos el paciente 02 es el que mayor sobrevida posee, con un seguimiento de 48 meses, sin muestra alguna de recaída clínica, hematológica o citogenética de su enfermedad; otro de los pacientes, el 18 posee sus tres determinaciones efectuadas dentro de los primeros 12 meses y los pacientes 5 y 8 entre los 24 y 36 meses; 3 pacientes (19%) viraron su resultado, Neg. > Pos. (pacientes 06-07-10) entre 24 y 36 meses, sin mostrar tampoco signos de recaída.
Finalmente en 4 casos, (pacientes 9-11-13-16) el viraje del resultado fue en sentido inverso al anterior, Pos. > Neg. entre los 24 y 36 meses post TMO.

Discusión

La Leucemia Mieloide Crónica (LMC) es una enfermedad clonal, en la cual se describió la primera alteración cromosómica asociada a una enfermedad maligna. Cualquier tratamiento con objetivo curativo busca la erradicación del clon leucémico y la negativización del gen quimérico BCR/ABL.
La terapéutica óptima para el tratamiento de la LMC en FC es motivo de controversias que enfrentan a los tratamientos con drogas versus el trasplante alogénico de médula ósea. Entre los tratamientos comunes figuran la HIU y el IFN; mientras el primero logra controlar las cifras de leucocitos y de plaquetas sin alterar la sobrevida, el segundo llega a producir remisiones citogenéticas, con alguna prolongación de la sobrevida pero sin lograr la curación de la enfermedad21-24.
La mortalidad relacionada con el tratamiento cuando se emplea el IFN es insignificante y la sobrevida media de 3 a 7 años.
Por su parte, el TMO con donante relacionado histoidéntico tiene su indicación para el tratamiento de la enfermedad en FC en especial en pacientes adultos jóvenes. La sobrevida libre de enfermedad está entre el 50 y el 60%25-28, pero en contraste con las terapias medicamentosas posee una mortalidad elevada, entre el 20 y el 30%; influyen en estas cifras la edad del paciente, la existencia de tratamientos con bulsulfán anterior al TMO, la depleción de linfocitos T y el intervalo entre el diagnóstico y el trasplante.
A nuestro protocolo de estudio ingresaron 19 pacientes afectados de LMC, 15 de ellos en FC y 4 en FAc. Todos ellos recibieron trasplantes de médula ósea alogeneico, con médula proveniente de un hermano HLA idéntico. La sobrevida actuarial lograda, (Fig. 4) es del 74%, con un seguimiento de 655 días, siendo comparables a los datos de R. Gale y col.29 que oscilan entre un 58% (52 a 64%), para pacientes de bajo riesgo y trasplantados dentro del año de diagnóstico, a 67% (63 a 73%) para pacientes con riesgo intermedio o alto. Por el contrario los tratamientos con HIU o IFN logran a 7 años sobrevidas del 49% (34 al 63%) y del 21% (12 al 31%) para pacientes con bajo riesgo y dentro del año del diagnóstico y para aquellos con riesgo intermedio y alto respectivamente.
En nuestro protocolo el TMO ha demostrado ser un tratamiento adecuado y de elección para los pacientes con LMC, tanto en FC como en FAc.
De los 4 pacientes trasplantados en FA, el 75% (3 pacientes) trasplantados están vivos y en remisión de su enfermedad.
La principal causa de mortalidad fue EICH agudo (3 pacientes) a pesar de la profilaxis establecida con 3 drogas (CsA+MTX+MP) y del tratamiento de dicha complicación. La mortalidad general del 26% está dentro de los parámetros de los diferentes centros que realizan TMO.
Ninguno de los pacientes con un seguimiento de 665 días ha experimentado recaída clínica, hematológica ni citogenética, siendo los estudios realizados para determinar la presencia del Ph1 reiteradamente negativos.
La incidencia y el significado de una quimera mixta (QM) post TMO es un aspecto no aclarado del TMO30, 31. Mediante sofisticadas técnicas moleculares de alta sensibilidad, PCR, se pudo comprobar que la QM no era rara y que diferentes porcentajes de células del receptor, eran encontradas por diferentes grupos de estu- dio32-36. La presencia de células del receptor, en bajos niveles no estaban asociadas con un incremento en el riesgo de recaída. La existencia de los microsatélites o VNTRs, distribuidos en el genoma humano permite al amplificarlos, su estudio para monitorear el «engraftment» y el estado quimérico hematopoyético post TMO.
En nuestro protocolo se utilizó la determinación de los polimorfismos del DNA, mediante los loci D1S80, APO B y D17S30, para establecer el grado de quimerismo post TMO. La determinación nos permitió establecer un quimerismo completo post TMO en el 100% de los pacientes estudiados, cuando se estudiaron los 3 loci. Estos resultados coinciden con los obtenidos por Gardiner y col.37, que establecen que la quimera mixta es un evento raro en TMO no manipulado, en contraste con aquellos trasplantes deplecionados de linfocitos T en los cuales es un hallazgo bastante común. Los resultados obtenidos por nosotros poseen relación con la ausencia de recaída de la enfermedad, ya que el 100% de los pacientes logró consolidar una quimera completa.
La recaída leucémica post TMO es una de las complicaciones principales post TMO, con cifras que oscilan entre el 10 y el 20%38. Una de las causas atribuidas a la recaída es la incapacidad del régimen mieloablativo para erradicar el clon leucémico. Las modernas técnicas de biología molecular, PCR, permiten detectar la trasloca-ción génica que determina la presencia del gen quimérico BCR/ABL y de su producto. La interpretación de este hallazgo y su relación con la recaída de la enfermedad es algo difícil de establecer.
Todos los pacientes fueron positivos para la traslo-cación BCR/ABL pre TMO; un 68.4% presentó la traslocación b3a2 y un 31.6% fue positivo para b3a2/b2a2.
En los pacientes que ingresaron al protocolo, existieron cuatro opciones posibles.
La primera representada por los pacientes 4, 14 y 15, quienes en su primer control post TMO habían negativizado la traslocación persistiendo la misma negativa en estudios ulteriores.
La segunda posibilidad la presentan los pacientes 9, 11, 13 y 16 que mostraron PCR+ para negativizarla posteriormente.
La tercera posibilidad la brindan los pacientes 6, 7 y 10 que viraron sus resultados de negativo a positivo, sin que este resultado tenga un correlato con el status de la enfermedad.
La conducta terapéutica con estos pacientes podría ser la inducción de un efecto injerto versus leucemia (IVL) reacción que forma parte de la EICH. Otra alternativa terapéutica sería tratar a estos pacientes con IFN buscando la negativización del híbrido BCR/ABL.
Pero es sin dudas el cuarto grupo, constituido por los pacientes 2, 5, 8 y 18, quienes nunca negativizaron la alteración genética, mostrando resultados reiteradamente positivos, el más intrigante.
Este grupo de pacientes persiste en remisión clínica, hematológica y citogenética, 44, 33, 31 y 8 meses post TMO, con persistencia del gen BCR/ABL, PCR+.
Los cuatro pacientes presentaron EICH aguda y crónica, en especial el número 2 quien presentó EICH agudo grado II y crónico sistémico, que por su manifestación clínica sería de esperar incluya una fuerte reacción IVL, capaz de negativizar la PCR.
En estos pacientes la infusión de linfocitos, buscando provocar la reacción, no tendría indicación, ya que el desarrollo de EICH incluiría IVL; quizás en estos pacientes la inclusión de IFN post TMO agregue un factor importante para negativizar el híbrido BCR/ABL.
Para algunos autores la negativización del híbrido es un requisito necesario para la curación de la enfermedad39-45. Los pacientes con larga sobrevida son sistemáticamente PCR negativos.
Otros grupos encuentran pacientes con PCR+, sobrevivientes de larga data, sin recaída hematológica, y con años de seguimiento sin que la posibilidad se altere46-53.
Lo cierto es que aquellos pacientes PCR negativo sobreviven a largo plazo; pero muchos pacientes muestran evidencias de largas sobrevidas aún con PCR+ lo que indicaría la posible existencia del clon leucémico varios años post TMO, por lo cual su valor pronóstico es limitado.
Nuestro trabajo coincide con las conclusiones de Gardiner y col.37 y de Goldman y Hughes54 sobre la falta de valor predictivo de una PCR positiva, ya que muchos de los pacientes incorporados al protocolo poseen PCR+ mucho tiempo después del TMO sin ningún signo de recaída de la enfermedad.
Por otra parte la determinación del híbrido ABL/BCR puede estar señalando la existencia de una población mieloide con escaso protagonismo hematopoyético, la existencia de linfocitos T o B de larga vida o un clon leucémico controlado por la reacción IVL provocada por las células trasplantadas.
La alternativa más racional para los pacientes con un viraje Neg. > Post. y para aquellos reiteradamente positivos sería implementar el seguimiento mediante PCR cuantitativa permitiendo de esta manera, monitorear la masa residual de la enfermedad y frente a un aumento significativo implementar terapias experimentales post TMO tales como IFN o transfusión de linfocitos.
En conclusión, 1) El TMO es un recurso terapéutico válido para pacientes afectados de LMC. La sobrevida actuarial para el grupo en estudio fue del 74%, con un seguimiento medio de 655 días. Todos los pacientes vivos están en remisión clínica, hematológica y citogenética de su enfermedad. La determinación del Ph1 fue en todas las oportunidades negativa post TMO.
2) Todos los pacientes alcanzaron una quimera hematológica total. Para comprobar la presencia del quimerismo fue necesario el empleo del estudio de 3 loci D1S80, APO B y D17S30. La presencia de una quimera completa además de certificar el «engraftment» del trasplante es un factor que influye de manera positiva para evitar la recaída de la enfermedad.
3) La presencia del transcripto BCR/ABL no es sinónimo de recaída de la enfermedad. La persistencia de estudios PCR+ en pacientes de larga evolución post TMO estaría indicando la presencia de células con escaso protagonismo hematopoyético, o linfocitos de larga vida, sin relación con la recaída de la enfermedad, y detectados por la extrema sensibilidad del método. No se encontró relación entre presencia o ausencia de EICH agudo y/o crónico y positividad para BCR/ABL.

Agradecimientos: Los autores agradecen la colaboración prestada por la Srta. Roxana Ariet y el Sr. Santiago Milone en la confección del presente trabajo.

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TABLA 1.– TMO: Características clínicas de los pacientes

Sexo Status al Período Régimen Profilaxis Reordenamiento
Paciente Edad D/R TMO Diag-Trasp. Condicionante EICH DNA

001 31 F/M FC < 1 año Bu/Cy CsA+MTX b3a2/b2a2
002 28 F/M FC < 1 año Bu/Cy CsA+MTX b3a2
003 44 M/F FC < 1 año Bu/Cy CsA+MTX+MP b3a2/b2a2
004 9 M/F FC < 1 año Bu/Cy CsA+MTX+MP b3a2
005 35 F/M FC > 2 años Bu/Cy CsA+MTX+MP b3a2
006 45 F/M FA < 1 año Bu/Cy/Ep CsA+MTX+MP b3a2
007 25 F/M FC < 1 año Bu/Cy CsA+MTX+MP b3a2
008 43 F/M FC < 1 año Bu/Cy CsA+MTX+MP b3a2/b2a2
009 39 M/F FC < 1 año Bu/Cy CsA+MTX+MP b3a2
010 37 F/M FC < 1 año Bu/Cy CsA+MTX+MP b3a2
011 43 M/F FA > 2 años Bu/Cy/Ep CsA+MTX+MP b3a2
012 44 F/M FC e/1-2 años Bu/Cy CsA+MTX+MP b3a2
013 47 F/M FA e/1-2 años Bu/Cy/Ep CsA+MTX+MP b3a2/b2a2
014 31 M/F FC < 1 año Bu/Cy CsA+MTX+MP b3a2
015 31 M/F FC e/1-2 años Bu/Cy CsA+MTX+MP b3a27b2a2
016 20 M/F FC < 1 año Bu/Cy CsA+MTX+MP b3a2
017 15 M/F FA < 1 año Bu/Cy/Ep CsA+MTX+MP b3a2
018 39 M/F FC < 1 año Bu/Cy CsA+MTX+MP b3a2
019 38 M/F FC < 1 año Bu/Cy CsA+MTX+MP b3a2/b2a2

D: Donante; R: Receptor; M: Masculino; FC: Fase Crónica; FA: Fase Acelerada; F: Femenino; Bu: Busulfán; Cy: Ciclofosfamida; Ep: Etoposido; CsA: Ciclosporina; MTX: Metrotexato; MP: Metilprednisona. Profilaxis EICH: Profilaxis Enfermedad Injerto vs. Huésped
TABLA 2.– Presencia y Tipo de EICH post TMO

Paciente Sobrevida Eich Agudo Eich Crónico
(meses) (estadio)

001 5 SI (IV) n.e.
002 40 SI (II) Sistémico
003 4 SI (III) n.e.
004 31 SI (I) NO
005 28 SI (II) Sistémico
006 27 SI (I) Sistémico
007 26 SI (I) NO
008 25 SI (II) Sistémico
009 24 SI (I) NO
010 23 SI (II) Sistémico
011 23 SI (II) Sistémico
012 5 SI (III-IV) n.e.
013 17 NO Sistémico
014 17 SI (I) NO
015 16 SI (I) Sistémico
016 15 NO Sistémico
017 2 n.e. n.e.
018 3 SI (II) Sistémico
019 1 SI (IV) n.e.

n.e.: no evaluado
TABLA 3.– Determinación de VNTRS

Pacientes D1S80 APO B D17S30

002 NI QC NI
004 NI NI QC
005 NI QC NR
006 QC NR NR
007 NI NI QC
008 NI QC NR
009 QC NR NR
010 QC NR NR
011 QC NR NR
012 NI NI QC
013 NI QC NR
014 NI QC NR
015 QC NR NR
016 QC NR NR
018 QC NR NR
019 NI QC NR

NI: No Informa; NR: No Realizado; QC: Quimera completa
Fig. 1.– Cromosoma Philadelphia, fusión BCR/ABL. Tomada con autorización del autor. Kantarjian H.M et al. Blood 1993; 82: 691-703.
Fig. 2.– Producto de amplificación y primers utilizados
M: Marcador 100 bp ladder, 100: Células k562 puras. 10-1-10-7: Diluciones de células K562 con células normales

Fig. 3.– Gel de agarosa, mostrando la sensibilidad del método
Fig. 4.– TMO en LMC - Sobrevida libre de enfermedad. (Método de Kaplan-Meyer)
M: Marcador 100 bp ladder. R: Receptor pre trasplante. D: Donante. T: Receptor post trasplante

Fig. 5.– Quimerismo Hematopoyético
M: Marcador 100 Bp ladder; 1: Pac. 14 traslocación b3a2; 2: Pac. control abl; 3: Pac. 6 traslocación b3a2/b2a2, 4: Pac. 6 control abl; 5: Pac. 4 negativo; 6: Pac. 4 control abl; 7: Control negativo

Fig. 6.– Detección del Gen Quimérico BCR/ABL amplificación mediante electroforesis en geles de agarosa.
Fig. 7.– Status de los pacientes pre y post trasplante de médula ósea