DETERMINACION POR PCR DE LA ASOCIACION ENTRE ANTIGENOS HLA CLASE II Y PENFIGO VULGAR

ROBERTO R. GLORIO1, GRACIELA RODRIGUEZ COSTA1, ROXANA HAAS2, JULIAN LARRIBA3, LEONARDO FAINBOIM3, ALBERTO WOSCOFF1

1 División Dermatología, 2 División Alergia e Inmunología, 3 División Inmunogenética,
Hospital de Clínicas José de San Martín, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires

Key words: Pemphigus vulgaris, HLA DR4

Resumen

El pénfigo vulgar (PV) es una enfermedad cutaneomucosa que se caracteriza por la presencia de au- toanticuerpos dirigidos contra la desmogleína 3, causando acantolisis y formación de ampollas. En el presente estudio se analiza la asociación de los antígenos HLA DR y HLA DQ en 30 pacientes caucásicos argentinos que padecen esta enfermedad comparada con una población control (N = 199) del mismo grupo étnico. La técnica utilizada fue PCR SSO. Los resultados muestran una asociación con HLA DR 4 (RR = 3.80, P = 0.001) y HLA DR 14 (RR = 5.97, P = 0.0001). En el caso de los subtipos moleculares DRb1* y DQb1*, los que están positivamente asociados con PV pertenecen a 2 alelos diferentes, tal como en otras poblaciones. El primero es DRb1* 0402 (RR = 44.70, P = 10.7) y DQb1* 0302 (RR = 71.82, P = 10.7) y el segundo es DRb1* 1401 (RR = 117.94, P = 10.7) y DQb1* 0503 (RR = 86.95, P = 10.7).

Abstract

PCR determination of an association between Class II HLA and pemphigus vulgaris Pemphigus vulgaris (PV) is an autoimmune blistering disease affecting the skin and mucous membranes. It is characterized by the presence of an autoantibody directed against desmoglein 3, which causes acantholysis and blister formation. In this study, we examined the HLA antigens of 30 caucasian argentinian patients compared with 199 controls. We used the PCR-SSO method (Polymerase Chain Reaction-Sequence Specific Oligonucleotide). We found that PV patients had significantly increased frequencies of HLA DR4 (RR = 3.80, P = 0.001) and HLA DR 14 (RR = 5.97, P = 0.0001). As in other populations, two associated alleles were found: the first was DRb1*0402 (RR = 44.70, P = 10.7) and DQb1* 0302 (RR = 71.82, P = 10-7) and the second was DRb1* 1401 (RR = 117.94, P = 10-7) y DQb1* 0503 (RR = 86.95, P = 10-7).

Dirección postal: Roberto Ricardo Glorio, French 2961, 1425 Buenos Aires, Argentina
Fax: 54-1-4804-3206

Recibido: 4-XII-1997 Aceptado: 4-XI-1998

Los pénfigos representan un grupo de enfermedades crónicas recidivantes, de fisiopatogenia autoinmune, que tienen en común la característica de presentar ampollas intraepidérmicas, cuyo mecanismo de formación es la acantolisis producida por autoanticuerpos dirigidos contra un epitope localizado en los desmosomas de los epitelios planos estratificados.
Se caracterizan por su respuesta al tratamiento esteroideo, pronóstico reservado y mortalidad elevada. El pénfigo vulgar (PV) es la forma clínica más frecuente y se caracteriza por la presencia de autoanticuerpos dirigidos contra la desmogleína 3, que es una glicoproteína de transmembrana de la familia de las cadherinas presente en los desmosomas1, 2, 3.
La incidencia de este cuadro varía de 0.1 a 0.5 casos por 100.000 habitantes, siendo mayor en judíos4. Se ha descripto una susceptibilidad genética (o disposición) a padecer pénfigo ligada al sistema de antígenos de histocompatibilidad (HLA) destacándose 2 haplotipos: DRb1* 0402 (DR4) DQb1* 0302 (DQ8) y DRb1* 1401 (DR14) DQb1* 0503 (DQ5)5, 9, 16-20.
Las relaciones entre HLA y patología no son estrictamente causales, es decir que lo conferido por los antígenos HLA no es la enfermedad misma, sino la tendencia o predisposición a padecerla.
Podríamos definir como disposición a contraer determinada enfermedad a la sumatoria de susceptibilidad y resistencia que rigen la probabilidad de que un sujeto contraiga realmente la enfermedad en cuestión10. El presente trabajo fue realizado considerando los recientes avances en las técnicas inmunogenéticas, que permiten profundizar el estudio de estos antígenos y la descripción de nuevas variantes alélicas de los mismos. En base a que existe una susceptibilidad genética a padecer pénfigo ligada al sistema de antígenos de histocompa-tibilidad (HLA) y a que no hay ningún trabajo de este tipo en nuestra población, decidimos realizar un estudio colaborativo entre la División Dermatología y la División Inmunogenética del Hospital de Clínicas José de San Martín, con el objetivo de:
a. Determinar la frecuencia de los antígenos HLA de clase II en pacientes con PV y el Riesgo Relativo (RR) que confieren para padecer dicha enfermedad.
b. Describir las variantes alélicas de los antígenos de clase II DR y DQ en los pacientes con PV y determinar el RR que aportan para la enfermedad.
c. Relacionar estos datos con las manifestaciones cutaneomucosofanerales.
d. Comparar nuestros hallazgos con lo informado en la bibliografía.

Material y métodos

Se efectuó un estudio observacional, prospectivo, transversal y controlado, entre los meses de marzo de 1995 y julio de 1997, en el cual se incluyeron 30 pacientes con diagnóstico de PV que concurren a la División Dermatología del Hospital de Clínicas José de San Martín y 199 pacientes control.
Población: Se realizó un tipo de muestreo consecutivo a partir de la consulta espontánea, dentro de una población de 60 pacientes anuales, incluyendo sólo los casos con diagnóstico histopatológico confirmado. Los pacientes y los controles corresponden al mismo grupo étnico, caucásicos argentinos, pertenecientes a una población homogénea cuyos ancestros son españoles, italianos o argentinos.
Como criterios de inclusión se tuvieron en cuenta los casos de PV con diagnóstico basado en la clínica de las lesiones de piel y mucosas confirmado con histopatología e inmunofluorescencia.
Se consideraron criterios de exclusión: Penfigoide ampollar, penfigoide cicatrizal, epidermolisis ampollar adquirida, dermatitis herpetiforme, herpes gestationis, eritema polimorfo, impétigo ampollar, dermatosis por Ig A lineal, dermatosis acantolítica transitoria, dermatosis pustular subcórnea, enfermedad de Darier o queratosis folicular.
La evaluación dermatológica fue realizada a partir de un protocolo previamente elaborado donde se consignaron las manifestaciones mucosocutaneofanerales en base al porcentaje de superficie corporal afectada (SCA) con la «regla de los nueve» descripta por Pulasky y Tenisson que asigna valores de 9 o múltiplos de 9 a los diferentes segmentos del cuerpo, por ejemplo, cabeza y cuello 9%, cada miembro superior 9%, parte anterior de tronco 18%, parte posterior de tronco 18%, cada miembro inferior 18% y región genital y periné 1%.
Tipificación HLA: Los alelos HLA-DRb1* y DQb1* fueron determinados por la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) seguida de hibridización por oligonucléotidos específicos de secuencia (PCR-SSO) (EXON 2). Los primers utilizados se muestran a continuación:
Amplificación genérica HLA-DRb1*:
Nombre: 2DR AMP A Secuencia:
ccccacagcacgtttc
(c/t) Tg (#)
Nombre: 2DRB AMP B Secuencia:
ccgctgcactgtgaagctcta (*)
Amplificación específica DRb1* DR4:
Nombre: 2DRB AMP 4 Secuencia:
gtttcttggagcaggttaaac
Nombre: 2DRB AMP B Secuencia:
ccgctgcactgtgaagctcta (*)
Amplificación específica DRb1* DR14:
Nombre: 2DRB AMP 3 Secuencia:
cacgtttcttggagtactctac
Nombre: 2DRB AMP B Secuencia:
ccgctgcactgtgaagctcta (*)
Amplificación específica DQb1*:
Nombre: 2DQB AMP A Secuencia:
catgtggtacttcaccaacgg
Nombre: 2DRB AMP B Secuencia:
ccgctgcactgtgaagctcta (*)
(*) Complementario. (#) mezcla de primers degenerados.
A partir de sangre periférica de los pacientes (variable en estudio) se realiza una extracción de ADN con el método de Salting out. Con 2 µl de ADN de cada paciente y primers específicos para los loci HLA DRb1* y DQb1* se realizó la amplificación por PCR de dichos loci.
El producto de la amplificación se siembra en una membrana de nylon y se hibridiza con oligonucleótidos específicos de secuencia (SSO) marcados con ATP (gP32). Para determinar los alelos del locus HLA-DRb1* se utilizaron aproximadamente 120 SSOs y para los del locus HLA-DQb1*, 36 SSOs. Las membranas hibridizadas se exponen a película autorradiográ-fica y luego se analizan los resultados11.
Análisis Estadístico: Las frecuencias independientes de los haplotipos y de los alelos fueron determinadas por recuento directo. La significación estadística de las diferencias en las frecuencias individuales de los alelos y haplotipos en los pacientes con PV y en la población control, fueron estimados por el método del chi cuadrado (c2). La fuerza de la asociación fue estimada calculando el RR, contando con el asesoramiento de la Sección de Asesoría Científica del Hospital de Clínicas José de San Martín.
RR = número de pacientes con antígeno x número de controles sin antígeno/número de pacientes sin antígeno x número de controles con antígeno
También se determinó la fracción etiológica

se aplica cuando el RR es > 1 y expresa la proporción en que influye la tenencia del antígeno entre los otros factores para que la enfermedad se produzca; y además la fracción preventiva

que se aplica cuando el RR es < 1, expresando la participación del antígeno en la resistencia de la enfermedad.
Recordemos que a es el número de los pacientes con el antígeno y que b es el número de los pacientes sin el antígeno, por lo tanto a + b es el número total de pacientes.

Resultados

Se evaluaron 30 pacientes con diagnóstico confirmado de PV. En cuanto a la edad, la media aritmética (X-) fue de 56.3 con un desvío estándar (DS) de 4.4 y un intervalo de confianza (IC) calculado con un a = 0.05% (IC 95%) de 54.3 – 58.5. La distribución por sexos mostró predominio de mujeres (19 pacientes) (63.3%) en relación a los hombres (11 pacientes) (36.7%).
Se analizaron los antígenos de clase II y se presentan los resultados más destacados en la Tabla 1.
En 16 pacientes con DR 4: 7 pacientes con < 10% de SCA (23.3%); 7 pacientes con compromiso de 10-30% de SCA (23.3%) y 2 pacientes con > 30% de SCA (6.7%). Se halló afectación cutaneomucosa en 11 pacientes, sólo cutánea en 2 pacientes y sólo mucosa en 3 pacientes, con episodios recurrentes en 13 pacientes y episodio único en 3 pacientes.
En 12 pacientes con DR 14: 7 pacientes con < 10% de SCA (23.3%); 3 pacientes con compromiso de 10-30% de SCA (10.0%) y 2 pac. con > 30% de SCA (6.7%). Hubo afectación cutaneomucosa en 7 pacientes, sólo mucosa en 3 y sólo cutánea en otros 2; con episodios recurrentes en 8 pacientes y episodio único en otros 4. Además se presentan los datos acerca de las variantes alélicas DRb1* y DQb1* de los 30 pacientes con PV en relación a los controles, en la Tabla 2.
En cuanto a la superficie corporal afectada (SCA) en cada uno de estos grupos, se observó:
En 13 pacientes con DRb1*0402: 7 pacientes con < 10% de SCA (53.8%); 4 con compromiso de 10-30% de SCA (30.8%) y 2 con > 30% de SCA (15.4%). Por otra parte, en 9 pacientes se halló afectación cutaneo-mucosa y en 10 recurrencia. En 11 pacientes con DRb1* 1401: 7 con < 10% de SCA (63.6%); 3 con compromiso de 10-30% de SCA (27.3%) y uno con > 30% de SCA (9.1%). Hubo afectación cutaneomucosa y recurrencia en 8 pacientes. En 16 pacientes con DQb1* 0302: 6 con < 10% de SCA (37.5%), 8 con compromiso de 10-30% de SCA (50%) y 2 con > 30% de SCA (12.5%). Se observó recurrencia en 12 pacientes y afectación cutaneomucosa en 9.
En 11 pacientes con DQb1* 0503: 7 con (37.5%); 8 con compromiso de 10-30% de SCA (50%) y 2 con > 30% de SCA, 10% de SCA (63.6%); 3 con compromiso de 10-30% de SCA (27.3%) y uno con > 30% de SCA (9.1%); con recurrencia en 7 pacientes y afectación cutaneomucosa en 6 pacientes.

Discusión

El inicio y desarrollo del PV puede resultar de la interacción entre factores externos (drogas, virus, etc.) y factores genéticos (genes desconocidos y especialmente alelos del CMH). Como hoy sabemos, los alelos del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (CMH), juegan un papel importante en la susceptibilidad para padecer la enfermedad, por ello es trascendente conocer cuáles son los alelos asociados con mayor frecuencia. En el presente estudio se demuestra una asociación significativa entre el PV y el CMH, en particular con antígenos de clase II.
La mayoría de los pacientes provenían del norte del país, y se destacó la baja proporción de judíos askenazi, lo que representa un hecho interesante ya que en otras casuísticas, ésta ha sido la población predominante. Hubo predominio de mujeres y el promedio de edad fue de 56 años, coincidente con otras publicaciones. Se aprecia una asociación positiva con los antígenos DR 4 y DR 14 (los que actuaron como factor de riesgo) en pacientes con PV y una asociación negativa para los antígenos DR 15 y DR 3.
El DR 4 y DR 14 tuvieron una Fracción Etiológica (FE) de 0.39 y 0.33 respectivamente, lo que significa que el 39% o 33% del peso causal depende de la presencia del antígeno.
El antígeno DR 8 fue hallado con mayor frecuencia en los pacientes con PV que en los controles aunque esta asociación no fue significativa.
En los pacientes con DR 4, hubo una cantidad similar de pacientes con < 10% y entre 10-30% de la SCA con episodios recurrentes en la mayoría de los casos.
En los pacientes DR 14, el compromiso < 10% de la SCA fue el predominante, con episodios recurrentes en un gran porcentaje de casos.
En el caso de los subtipos moleculares DRb1* y DQb1*, los más positivamente asociados con PV, forman parte de 2 haplotipos diferentes: el primero es (DRb1* 0402) (DQb1* 0302) y el segundo es (DRb1* 1401) (DQb1* 0503).
Es decir que en los haplotipos DR 4, el subtipo molecular DRb1* 0402 es el que confiere mayor susceptibilidad, resultando la asociación con DQb1* 0302 secundaria a desequilibrio de ligamiento. Si se remueven los individuos con DRb1* 0402, la asociación con DQb1* 0302 desaparece.
Algo similar ocurre con el DR 14, siendo el alelo DRb1* 1401 el que confiere mayor susceptibilidad, resultando el DQb1* 0503 en desequilibrio de ligamiento.
La importancia de identificar los alelos que confieren susceptibilidad radica en su papel trascendente en la respuesta inmune con el fin de diseñar estrategias inmunoterapéuticas en el futuro.
Se debe destacar que el alelo DRb1* 1401 fue más frecuente en los pacientes que tenían un compromiso menor del 10% de la superficie corporal afectada, mientras que la presencia del alelo DRb1* 0402 fue predominante en los pacientes que tenían un compromiso entre el 10 y el 30% de la superficie corporal, lo que podría ser de valor en la evaluación de estos pacientes aunque se requieren otros estudios para comprobarlo.
El genotipo DRb1* 0402-DRb1* 1401 fue hallado en pacientes con PV más frecuentemente que lo esperado (5 pacientes) lo que sugiere un sinergismo entre ambos haplotipos para conferir susceptibilidad. Desde hace tiempo, se conoce una susceptibilidad genética asociada con HLA A26 B38 y DR4 y una mayor incidencia de la enfermedad en judíos askenazi en un trabajo realizado sobre 65 pacientes12.
Luego se encontró una asociación del DR4 con la variante alélica DQb1* 0302 (DQ8) en 26 pacientes judíos askenazi13, y de DR4, DQ8 junto a DR6 DQ5 en 25 pacientes caucasoides no judíos14, 15.
Por otra parte, entre los japoneses, sobre 32 pacientes, se destacaron 2 haplotipos predisponentes, DR14 DQ5 y DR6 DQ5 y uno que confería resistencia a PV que es DR7 DQ616, 17.
También se presentó en la India un trabajo sobre 37 pacientes siendo la asociación significativa con PV de DRb1* 1401 (DR14) DQb1* 0503 (DQ5) y en italianos, sobre 32 pacientes, 2 haplotipos DRb1* 0402 (DR4) DQb1* 0302 (DQ8) y DRb1* 1401 (DR14) DQb1* 0503 (DQ5), esto último es coincidente con la población argentina18, 19, 20.
El análisis de los haplotipos predisponentes muestra que la frecuencia de los componentes alélicos y la fuerza de su asociación con PV se incrementa progresivamente hacia la dirección telomérica, con un valor pico para los alelos DR y DQ.
Esto es concordante con la hipótesis de que los factores genéticos responsables de la susceptibilidad al PV están más probablemente situados en la región clase II del sistema HLA.
Los estudios llevados a cabo sobre el locus DP, están todos de acuerdo en la exclusión de este locus en la susceptibilidad al PV. Por consiguiente parece que los factores genéticos involucrados son teloméricos con respecto al locus DP y más probablemente localizados alrededor de la región DR y DQ.
Se postula que existe una base estructural de los alelos asociados que permite que éstos presenten correctamente péptidos del autoantígeno desmogleína 3 a linfocitos T autorreactivos, de ahí que la presentación antigénica sea el mecanismo más probable para explicar las asociaciones de ciertos alelos HLA con PV21.
La fuerte asociación con antígenos de clase II y la vinculación con otros fenómenos clínicos autoinmunes sugieren que ésta es una enfermedad inmunológica-mente mediada.
El hecho de que la mayoría de las enfermedades relacionadas al sistema HLA-clase II, tales como artritis reu-matoidea, diabetes insulinodependiente o lupus eritemato-so tengan una base inmunológica, sugieren que DR y DQ son ellos mismos, genes que predisponen a padecer la enfermedad y que la base genética para el desarrollo de la misma involucra una serie de disturbios en la inmu-norregulación, que van desde la presentación antigénica inadecuada hasta la pérdida de la autotolerancia.

Agradecimientos: A la Asesoría Científica del Hospital de Clínicas José de San Martín.

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TABLA 1.– Resultados de la determinación por PCR de la asociación entre antígenos HLA clase II-DR en 30 pacientes de pénfigo vulgar (PV) y en 199 controles.

Pénfigo Controles
Vulgar N = 30 N = 199
N° % N° % P RR (I C 95%) X- FE/FP

DR4 16 53.33 46 23.11 0.0011464 3.80 (1.59-9.06) 10.57 0.39
DR 14 12 40.00 20 10.05 0.0001153 5.97 (2.25-15.2) 17.04 0.33
DR 8 9 30.00 29 14.57 0.0342347 2.51 (0.92-6.41) 3.44 0.18
DR 15 1 3.33 39 19.59 0.0287278 0.14 (0.00-0.91) 3.72 0.028
DR 3 2 6.66 42 21.10 0.0613141 0.27 (0.03-1.14) 2.63 0.048

RR: Riesgo relativo. IC: Intervalo de confianza. X-: media
FE: Fracción etiológica
FP: Fracción preventiva
TABLA 2.– Variantes alélicas DRb1* y DQb1* en 30 pacientes con pénfigo vulgar (PV) y en 199 controles

Pénfigo Controles
Vulgar N = 30 N = 199
N° % N° % P RR (I C 95%) X- FE/FP

DRb1* 0402 13 43.33 6 3.01 10.7 044.70 (13.96-143.14) 103.01 0.42
DQb1* 0302 15 50.00 18 9.04 10.7 071.82 (9.82-524.98) 65.73 0.49
DRb1* 1401 11 36.66 7 3.51 10.7 117.94 (16.13-862.27) 101.69 0.36
DQb1* 0503 11 36.66 10 5.02 10.7 086.95 (11.81-640.05) 74.83 0.52

RR: Riesgo relativo. IC: Intervalo de confianza. X-: media
FE: Fracción etiológica
FP: Fracción preventiva