PAPEL DEL OXIDO NITRICO EN LA RESPIRACION CELULAR

SALVADOR MONCADA

The Wolfson Institute for Biomedical Research, University College, London, UK

Key words: nitric oxide, cell respiration oxidative stress

Resumen

El óxido nítrico (ON) sintetizado de manera constitutiva en una célula generadora, actúa sobre otra célula efectora como regulador fisiológico del tono vascular, de la inhibición plaquetaria o de la interacción neurona-neurona. En forma contraria, la liberación inducida de grandes cantidades de ON por períodos largos transforma al ON de un mediador fisiológico en una molécula citostática y citotóxica. La presencia de ON sintetasa en la mitocondria sugiere que la producción fisiológica de ON en pequeñas cantidades estaría relacionada con la regulación de la respiración celular a través de la inhibición de la citocromo oxidasa. La exposición celular a ON por períodos prolongados da como resultado una inhibición irreversible de la respiración celular que es independiente de la formación generalizada de superóxido o de peroxinitrito. La inhibición de la respiración celular es persistente excepto si se estudia el complejo IV aislado, si se bloquea el complejo I o si se pone glutatión. De esta manera nuestra hipótesis es que la inhibición del complejo IV es un efecto fisiológico normal, dependiente de las concentraciones de ON. Si se expone las células a ON por períodos largos, se nitrosilan tioles en el complejo I y a medida que se están nitrosilando, el glutatión transnitrosila y limpia el complejo I hasta que el glutatión cae a un nivel crítico. En estas condiciones se produce la inhibición irreversible de la respiración y posiblemente, este sea el camino que transforma al ON de un mediador fisiológico en una molécula con efectos patológicos. Asi mismo, creemos que la nitrosilación de tioles y la transnitrosilación por el glutatión constituyen un mecanismo crítico de la prevención del stress oxidativo.

Abstract

Role of nitric oxide in cell respiration. Nitric oxide (NO) synthesized in a constitutive manner by a cell, acts on effector cells as a physiological regulator of the vascular tone, of platelet inhibition and of neuron-neuron interaction. By contrast, the release for longer periods of time of higher amounts of inducible NO, transforms NO from a physiological mediator into a cytostatic and cytotoxic molecule. The presence of NO synthetase in mitochondria suggests that physiological small amounts of NO could be involved in cellular respiration regulation by inhibition of cytochrome oxidase. Long exposure of cells to NO results in an irreversible inhibition of cellular respiration not dependent on a generalized superoxide or peroxynitrite formation. Cellular respiration inhibition could be reverted by either analyzing complex IV alone, by blocking Complex I or by the addition of gluthation. Therefore, our hypothesis is that suppression of complex IV is a normal physiological effect dependent on NO concentration. When cells are exposed to NO for longer periods of time, thiol groups are nitrosilated in complex I while gluthation transnitrosilates until its level drops to critical values. At this point, cellular respiration is blocked and this could be the pathway by which NO is transformed from a physiological mediator into a pathological molecule. We also believe that thiol nitrosilation and transnitrosilation by gluthation is a critical mechanism involved in oxidative stress prevention.

Dirección postal: Dr. Salvador Moncada, The Wolfson Institute for Biomedical Research, University College, 140 Tottenham, Court Road, London WIP9LN, United Kingdom, Fax: 171-209-0470.

Los nitrógenos de los grupos guanido terminales de la L-arginina son utilizados por la enzima óxido nítrico (ON) sintetasa para la síntesis de ON, que con la citrulina son los co-productos de la reacción enzimática1, 2. La enzima ON sintetasa incorpora oxígeno molecular en la síntesis de estos productos, primero en la formación del compuesto intermedio, la N-hidroxi-L-arginina y posteriormente, en la formación de la L-citrulina3, 4. Se acepta que el ON formado en una célula generadora es transferido a una célula efectora donde juega un papel fisiológico sea, de regulación del tono vascular, de inhibición de la agregación plaquetaria o de la interacción neurona-neurona. Las acciones fisiológicas del ON están dadas por la activación de la enzima guanilato-ciclasa y por el aumento de los niveles de GMPc (GMP-cílico) en la célula efectora. Las enzimas que han sido caracterizadas como responsables de la síntesis de ON son: las de naturaleza constitutiva que son expresadas en las células endoteliales y en las neuronas y la de naturaleza inducible, que se expresa durante procesos infecciosos e inflamatorios. Esta última enzima es distinta de las constitutivas porque es capaz de producir ON en grandes cantidades y por períodos largos. Fue originalmente identificada en macrófagos murinos en los cuales se descubrió que si no son activados inmunológicamente no liberan ON pero si son activados por lipopolisacáridos o por ciertas citoquinas, hay un proceso de inducción de la enzima ON sintasa que es capaz de producir grandes cantidades de ON por períodos de 24 a 48 hs. Esta es la diferencia más importante que transforma al ON de un mediador fisiológico que regula el tono vascular que funciona como sistema de interacción neuronal, etc, en una sustancia citostática y citotóxica5-7.
Las células blancas activadas son capaces de luchar contra microorganismos invasores, a través de la liberación de grandes cantidades de ON. El efecto del ON empieza a ser más allá de la acción sobre la guanilato-ciclasa, pues se extiende a enzimas mitocondriales, especialmente en el complejo IV y el complejo I, o a enzimas responsables de la síntesis de DNA, especialmente la reductasa de ribonucleótidos8. Esta es la forma a través de la cual el ON se convierte de factor fisiológico en factor citostático y posiblemente citotóxico. La formación de ON en grandes cantidades además de en los macrófagos, ocurre en la pared arterial si el tejido vascular es expuesto a lipopolisacáridos, o a ciertas citoquinas. Esas acciones se comprueban en animales de laboratorio inyectados con endotoxina y también en un paciente en shock séptico. En la situación de shock, el ON es producido en grandes cantidades por diversos órganos lo que explica la vasodilatación, la hiporreactividad para vasoconstrictores y posiblemente, el defecto respiratorio característico del estado de shock9.
Cómo es que el ON es capaz de ir de la fisiología a la patofisiología? Una de las respuestas es que para producir efectos fisiopatológicos el ON tiene que estar presente por períodos largos. En períodos cortos, grandes cantidades de ON tienen poco efecto. Menores cantidades por períodos largos son capaces de transformar los procesos fisiológicos en fisiopatológicos. Otra explicación estaría relacionada con nuestros hallazgos sobre los mecanismos de acción de los bloqueantes del ON. Hace 11 años encontramos que el anión superóxido estaba involucrado en la destrucción del ON y que la superóxido dismutasa era capaz de prolongar la vida media del ON10. Hallamos que todos los inhibidores del ON excepto la hemoglobina (que atrapa el ON) actúan por su capacidad redox y son capaces de liberar anión superóxido en solución. Un año después describimos que los neutrófilos activados liberan no sólo ON sino también superóxido de tal manera que el superóxido cancela la acción del ON11. En esa época empezamos a pensar que la interacción del ON con el superóxido iba a ser importante para entender la acción biológica final del ON.
Aproximadamente un año después, Beckman12 en los EE.UU sugirió que la interacción entre superóxido y ON llevaba a la formación de peroxinitrito que es un oxidante muy potente. Cuando es protonado, el ácido peroxinitrito lleva a la formación de radicales hidroxilo y nitrito que producen daño tisular. Nosotros no estamos de acuerdo con que el peroxinitrito siempre produce daño. Hemos encontrado y publicado una serie de trabajos demostrando que la acción del peroxinitrito en los tejidos depende de la situación antioxidante del mismo. Observamos que si poníamos peroxinitrito directamente sobre plaquetas suspendidas en solución fisiológica, se producía no sólo agregación plaquetaria, sino también daño celular13. Cuando las plaquetas se suspendían en plasma, o en solución fisiológica con pequeñas cantidades de albúmina o glutatión, el peroxinitrito no sólo no producía daño sino que era capaz de regenerar ON y ser un protector celular. Esto es debido a que el peroxinitrito actúa rápidamente con el glutatión (formando nitroglu-tatión) o con otros grupos tioles capaces de ser nitrosilados y regenera ON, lo que genera una situación de balance. Posteriormente demostramos lo mismo en la circulación coronaria donde el peroxinitrito es capaz de producir vasodilatación de la circulación coronaria, taquifiláctica, debido a que produce daño tisular14. Este fenómeno se puede prevenir si se añade al sistema una solución de tioles. Los tioles hacen que el peroxinitrito regenere ON y la taquifilaxis no se produce. De esta manera surgen dos conceptos importantes a saber: primero, la dependencia del efecto del peroxinitrito de la situación biológica del tejido donde el peroxinitrito es liberado, segundo, la acción de los tioles sobre el peroxinitrito regenerando ON, que es un protector.
En ese tiempo comenzamos a pensar que posiblemente podría haber directamente formación de peroxinitrito en la mitocondria. Hace unos años se hicieron varios descubrimientos interesantes respecto al efecto del ON en el proceso de la respiración celular. Se descubrió que el ON en concentraciones fisiológicas bloquea la citocromo-oxidasa (CO) de una manera reversible y competitiva con oxígeno15-17. El descubrimiento de que la mitocondria misma tiene ON sintetasa18 hace pensar que el ON producido directamente en la mitocondria en pequeñas cantidades regula la respiración celular. Es posible que la CO efectivamente sea el sensor de oxígeno de las células que es regulado a través del efecto de concentraciones fisiológicas de ON.
Por otro lado otros grupos y nosotros también encontramos que el peroxinitrito, a diferencia del ON, inhibe el complejo I y el complejo III17, 19 de una manera irreversible. La hipótesis que sugerimos fue que si efectivamente se produce ON en concentraciones grandes capaces de bloquear la citocromo oxidasa por un período largo tal vez empieza a haber generación de superóxido en la mitocondria. En estas condiciones, el superóxido reaccionaría con el ON dando lugar a la formación de peroxinitrito lo que inhibe a los complejos I y III. Estas inhibiciones podrían ser el camino que va del control fisiológico de la respiración celular a una situación patológica de efecto citotóxico.
Un aspecto importante para resolver nuestra hipótesis era encontrar una forma de liberar ON por períodos largos y poder hacer estudios rigurosos de lo que ocurre en esas condiciones. Surgió un compuesto (DETA) que es capaz de liberar ON por períodos largos en concentraciones constantes. Encontramos que si ponemos el dador de ON por una hora se produce inhibición del consumo de oxígeno que es reversible por hemoglobina. Si se aumenta la concentración o el tiempo de exposición al DETA el proceso de inhibición de la respiración celular se torna persistente.
Se estudió la respiración por complejo IV. Con este sistema, la inhibición del mismo fue reversible cuando las células fueron expuestas al dador de ON por 1 o por 6 horas. Por lo tanto la persistencia del proceso estaba pasando por algún otro lugar. Nuestra hipótesis era que si se inhibe el complejo IV por suficiente tiempo se forma superóxido y peroxinitrito y se inhiben los complejos I y III. Empezamos a buscar pruebas de la formación de peroxinitrito pero no encontramos ninguna. De esta manera, la inhibición irreversible del proceso respiratorio, no sería debido a la producción de grandes cantidades de superóxido que permitirían la formación generalizada de peroxinitrito. Estudiamos entonces cada una de las enzimas involucradas usando diferentes substratos e inhibidores. Lo que encontramos fue que cualquier cosa que se hiciera, el proceso siempre se transformaba en persistente, excepto si bloqueábamos el complejo I, poníamos succinato, o si estudiábamos el complejo IV aislado.
La conclusión a la que hemos llegado es que sólo hay un punto de bloqueo después del complejo IV que es irreversible y ese punto es la inhibición del complejo I que no parece ser debida a la formación generalizada de superóxido o de peroxinitrito. Qué es entonces lo que sucede si se bloquea el complejo I transitoriamente? La inhibición se revierte de manera espontánea y no completa por un período de 25 hs. Si se pone el ditiol DTT, un reductor potente, las células comienzan a respirar nuevamente en un proceso que depende de la concentración de DTT, es decir que cualquiera sea el proceso de inhibición del complejo I, es sensible a cambios redox en el medio intracelular. Cuando medimos glutatión para averiguar qué pasaba con los sistemas de protección celular, encontramos que ON, en concentraciones crecientes produce una caída de los niveles de glutatión. Al agotarse el glutatión celular, el proceso de inhibición de la respiración celular por ON ocurriría más rápidamente. Pensamos entonces, que lo que el ON hacía en los experimentos anteriores era nitrosilar tioles en el complejo I. Los nitrosotioles son compuestos de color rojo, capaces de ser descompuestos por la luz. Iluminamos las células que no estaban respirando con una luz fría de alta intensidad y las células que estaban inhibidas comenzaron a respirar inmediatamente. También podíamos revertir el proceso poniendo glutatión. Este es un resumen de resultados que están por publicarse20.
La hipótesis con la que estamos trabajando es que la inhibición del complejo IV es un efecto fisiológico normal, dependiente de las concentraciones de ON. Si se expone las células a ON por períodos largos, lo que hace el ON es nitrosilar tioles en el complejo I y a medida que se están nitrosilando esos tioles, el glutatión transnitrosila y limpia el complejo I hasta que el glutatión cae a un nivel crítico.
Entonces se produce la inhibición irreversible de la respiración y posiblemente éste sea el camino que va de la fisiología a la fisiopatología. Ahora, lo que no sabemos es, y esa es la pregunta en este momento, si la nitrosilación de los tioles en el complejo I también requiere de peroxinitrito. Pero, no es peroxinitrito formado de una manera global, sino la liberación específica concentrada de superóxido en el complejo I, que permite la formación «in situ» de peroxinitrito y la nitrosilación de los tioles. Yo creo que la nitrosilación de tioles y la transnitrosilación por el glutatión constituyen un mecanismo crítico por el cual, por primera vez, estamos realmente entendiendo cómo los tioles podrían estar protegiendo contra el stress oxidativo y como el ON, que es una molecula reguladora de importancia fisiológica, se transforma en una entidad fisiopatológica.

Agradecimientos: Se agradece a la Dra. Mirta Schattner la transcripción y compaginación de la conferencia.

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