MARCADORES DE GENERACION DE TROMBINA EN INSUFICIENCIA RENAL DE NIÑOS CON SINDROME UREMICO HEMOLITICO EPIDEMICO

ROSANA F. MARTA2, LETICIA FLORENTIN1, MARIO DIAZ1, PATRICIA INDABURU2, JULIO C. SANCHEZ AVALOS, FELISA C. MOLINAS2*

1 Sección Nefrología, Hospital de Pediatría Juan p. Garrahan; 2 Laboratorio Hematología-Investigación, Instituto de Investigaciones Médicas Alfredo Lanari, Facultad de Medicina, universidad de Buenos Aires

* Miembro de la Carrera de Investigador del CONICET (Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas)

Key words: HUS, kidney insufficiency, thrombin generation

Resumen

Se presentan aquí los niveles de los marcadores tempranos de activación de la coagulación y del TNF-a en 12 niños con la forma epidémica del síndrome urémico hemolítico, de 16 meses de edad, (12-18) (mediana y rango) Todos los pacientes se recuperaron de la enfermedad dentro de las 2 a 4 semanas de evolución. Se tomaron cuatro muestras de sangre: al ingreso al hospital, luego en la primera y segunda semana y en la remisión. Las determinaciones del F1+2, TAT y TNF-a se realizaron por técnicas de ELISA comerciales, mientras que el factor von Willebrand se determinó por el método de Laurell. Los valores de F1+2 y del TAT al ingreso fueron 7.8 nM (3.7-12.3) y 22.7 ng/ml (8-76) respectivamente. Además, se encontró correlación significativa entre los niveles de F1+2 vs creatinina sérica, r:0.47 p < 0.001; F1+2 vs úrea sérica, r:0.66 p < 0.001; TAT vs creatinina sérica, r:0.77 p < 0.001; TAT vs urea, r:0.59 p <0.001. La mediana del FvW al ingreso en 11/12 niños fue de 260% (170-420). Los niveles del FvW se correlacionaron con los del F1+2; r:0.77 p < 0.001 y con los del TAT, r:0.41 p < 0.01. Los valores de estos marcadores séricos tendieron a normalizarse con la mejoría de la enfermedad. Se encontró una correlación negativa entre el recuento plaquetario y los niveles del F1+2, r:-0.64 p<0.001. Los niveles de TNF-a estuvieron aumentados en 5 niños, 22.2 pg/ml (17.2-53.7). Los resultados sugieren que estas anormalidades pueden ser atribuidas a un estímulo común sobre células endoteliales.

Abstract

Markers of thrombin generation in epidemic hemolytic uremic syndrome with kidney insufficiency. We present herein the levels of the early markers of blood coagulation activation and TNF-a in 12 children with the epidemic form of the hemolytic-uremic syndrome, median age 16 months, range 12-18. All patients recovered from the disease within 2 to 4 weeks. Four blood samples were collected: at admission, 1 week and 2 weeks later and on remission. Prothrombin fragments 1+2 (F1+2), thrombin-antithrombin complex (TAT) and tumor necrosis factor alpha (TN-a) were assayed by commercial ELISA techniques, while von Willebrand factor (vWf) was measured by Laurell’s method. At admission, F1+2 and TAT levels were 7.8 nM (3.7-12.3) and 22.7 ng/ml (8-76), respectively. Besides, significant correlations were obtained for F1+2 levels vs blood creatinine, r:0.57 p<0.001; F1+2 vs urea, r:0.66 p<0.001; TAT vs blood creatinine, r:0.77 p<0.001; TAT vs blood urea, r:0.59 p<0.001. Median vWf value at admission in 11/12 children was 260% (170-420), correlating with F1+2, r:0.77 p<0.001 and with TAT, r:0.41 p<0.01. Such values tended to normalize with the improvement of the disease. A negative correlation was found for platelet count vs F1+2, r:-0.64 p<0.001. TNF-a levels were increased in 5/12 children, 22.2 pg/ml (17.2-53.7). These results may be attributable to similar stimuli on endothelial cells.

Dirección postal: Dra. Felisa C. Molinas, Instituto de Investigaciones Médicas Alfredo Lanari, Combatientes de Malvinas 3150, 1427 Buenos Aires, Argentina
Fax: 54-1-523-8947; e-mail: fmolines@mail.vetina.ar

Recibido: 19-VI-1997 Aceptado: 27-VIII-1997

El síndrome de microangiopatía trombótica se caracteriza por anemia hemolítica microangiopática, trombocitopenia por mecanismo periférico, insuficiencia renal y manifestaciones neurológicas1-3. La púrpura trombocitopénica trombótica (PTT) y el síndrome urémico hemolítico (SUH) son las dos variantes más ampliamente reconocidas de la entidad4. El SUH puede aparecer esporádicamente a cualquier edad, mientras que la forma epidémica predomina en niños expuestos a infección por Escherichia coli y Shigella disenteriae tipo I5-7. Las verocitotoxinas producidas por estas bacterias producirían injuria endotelial desencadenando liberación de citoquinas8, 9, deficiencia en la síntesis de prostaciclina10, activación plaquetaria con biosíntesis aumentada de tromboxano11-13, así como activación de leucocitos y de los sistemas de coagulación y fibrinolisis14-16. Por otro lado, se ha observado que el TNF-a y la IL-1 inducen la expresión de receptores de verocitotoxina sobre cultivo de células endoteliales humanas17. En algunos casos de la forma esporádica del SUH y de la PTT, se han reportado anormalidades plaquetarias y del factor von Willebrand18, 19, junto con el aumento de los niveles de marcadores tempranos de la activación de la coagulación y la fibrinolisis15, 16. A diferencia de las anormalidades de la función plaquetaria que se encontraron en la mayoría de los pacientes con SUH13, 20, la activación de la coagulación se encontró sólo en pacientes severamente comprometidos21, 22. Se ha propuesto que los niveles aumentados de citoquinas encontrados en algunos pacientes con síndrome de microangiopatía trombótica podrían jugar un rol patogénico en la enfermedad9, 23. Se sugirió que el TNF-a y IL-1 eran las citoquinas involucradas en la inducción de la expresión del factor tisular en cultivo de células endoteliales, tendiendo esto a la activación del factor VII24, 25. Sin embargo, recientemente se ha descripto que la IL-6 es la citoquina que induce activación de la coagulación poniéndose esto de manifiesto por el aumento de los niveles de F1+2 y TAT26, mientras que el TNF parece estar involucrado en la activación de la fibrinolisis27. Se propuso que la causa de las anormalidades hemostáticas encontradas en pacientes con sepsis y en sujetos normales post infusión de TNF podría ser la interacción entre citoquinas y células endoteliales, monocitos y neutrófi-los28, 29. Estas alteraciones podrían cumplir un rol también en niños con SUH. Se hallaron niveles aumentados de TNF-a en la mayoría de los niños con SUH en Argentina9, así también como en adultos con PTT23. No obstante, en otros estudios, sólo se encontraron niveles aumentados de TNF-a en una minoría de niños con SUH14.
Nosotros dosamos los niveles de marcadores tempranos de activación de la coagulación y la fibrinólisis y TNF-a en un grupo de 12 niños con microangiopatía trombótica que presentaban un cuadro clínico típico de la forma epidémica de SUH. El objetivo del estudio fue correlacionar los niveles de F1+2, TAT y TNF-a con los hallazgos clínicos y de laboratorio, en particular con aquellos relacionados con falla renal aguda.

Material y métodos

Pacientes: se incluyeron en el estudio doce niños admitidos en el Hospital de Pediatría Juan P. Garrahan, con una mediana de edad de 16 meses, rango 12 a 28. El diagnóstico de síndrome urémico hemolítico (SUH) se estableció por la presencia de anemia hemolítica microangiopática, tromboci-topenia y falla renal aguda. Diez de esos niños recibieron una a dos transfusiones de sangre entera y el mismo número de pacientes fueron sometidos a diálisis peritoneal (1 sesión en 1 niño, 2 en 2, 3 en 3, 5 en 3 y 9 en 1 caso). Todos los pacientes se recuperaron de la enfermedad entre las 2 y 4 semanas.
La recolección de sangre para investigación clínica fue aprobada por el Comité de Etica del Hospital de Pediatría Juan P. Garrahan.
Recolección de sangre: se tomaron cuatro muestras de sangre: al ingreso, a la semana, a las dos semanas y en la remisión (2 meses después del ingreso). Durante la fase aguda de la enfermedad las muestras de sangre se obtuvieron antes de la diálisis peritoneal. El anticoagulante usado fue citrato trisódico 129mM en relación 1:9 (v:v). El plasma pobre en plaquetas se preparó por centrifugación a 2500 g durante 20 min a temperatura ambiente, se alicuotó y se guardó a -70° C hasta su utilización.
Ensayos de coagulación: el fragmenteo 1+2 de la protrombina (F1+2) y el complejo trombina-antitrombina (TAT) se midieron por técnicas de ELISA según descripción de Pelzer y col30, 31, empleando reactivos comerciales (Behring-werke, AGG, Marburg, Germany). Los rangos normales para F1+2 y TAT sugeridos por los fabricantes son 0.44-1.11 nM y 1.0-4.1 ng/ml, respectivamente. El vWf:Ag se midió por técnica de Laurell32 usando un anticuerpo monoespecífico (Assera vWF, Diagnostica Stago, Asnieres, France). El recuento plaquetario se realizó mediante un contador hematológico automatizado.
Ensayo de factor de necrosis tumoral (TNF): se midió en la muestra del ingreso usando un equipo comercial de ELISA (Sigma, St Louis, MI, U.S.A.). El valor normal dado por el fabricante es < 15.6 pg/ml mientras que el límite de detección es 4.4 pg/ml.
Análisis estadístico: Los datos se presentan como mediana y rango. Se realizó el análisis de covarianza de acuerdo al método de Bland y Altman33.

Resultados

Los datos de laboratorio de los pacientes con SUH al ingreso incluyeron: hematocrito, 22% (17-29) (mediana y rango); hemoglobina, 8.1 g/dl (6.7-11.6); recuento de glóbulos blancos, 19.5 x 1.000/µl (13.8-35); recuento de plaquetas, 65 x1.000/µl (21-131); urea sérica, 1.87 g/l (1.21-3.7); creatinina sérica, 3.45 mg/dl (1.6-8.8).
Como se muestra en la Fig. 1, los niveles de F1+2 y TAT al ingreso estuvieron aumentados con valores de 7.8 nM (3.7-12.3) y 22.7 ng/ml (8-76), respectivamente. Los niveles disminuyeron progresivamente con la mejoría del estado clínico. En la convalecencia, 2 meses más tarde, los valores de F1+2 se normalizaron en 8/10 pacientes, 1.0 nM (0.9-1.1), mientras que permanecieron aumentados en los otros 2 casos, 1.9 nM y 2.6 nM, probablemente debido a una infección viral. En cambio, los niveles de TAT fueron normales en los 10 niños evaluados en la convalecencia, 3.2 ng/ml (0.7-4.5). Al inicio de la enfermedad microangiopática, los niveles de FvW fueron superiores al nivel normal en 11/12 pacientes, con una mediana de 260% (170-420) y disminuyeron progresivamente a valores normales en 10 niños, 100% (70-150), mientras que fue de 170% en los dos pacientes restantes (Fig. 2). Se encontró una correlación significativa entre el FvW y los niveles de F1+2, r:0.77 p<0.001 y entre el FvW y TAT, r:0.41 p<0.01. Se encontró además una correlación negativa entre el recuento plaquetario y el FvW, r:-0.58 p<0.001 y los niveles de F1+2, r:-0.64 p<0.001.
También se obtuvo una correlación significativa entre los valores de los estudios hemostáticos con la creatinina y urea sérica (Tabla 1): F1+2 vs creatinina; r:0.57 p<0.001; F1+2 vs urea, r:0.66 p<0.001; TAT vs creatinina, r:0.77 p<0.001; TAT vs urea, r:0.57 p<0.001; FvW vs creatinina, r:0.59 p<0.001; FvW vs urea, r:0.65 p<0.001. Se encontró una correlación negativa entre el recuento plaquetario y creatinina, r:-0.52 p<0.001 y entre el recuento plaquetario vs urea, r:-0.71 p<0.001.
Los niveles de TNF-a estuvieron aumentados al ingreso en 5 niños (41%), 22.2 pg/ml (17.2-53.7) y se encontraron normales o no detectables en los otros 7 pacientes.

Discusión

Los niveles de los marcadores tempranos de generación de trombina, F1+2 y TAT, estuvieron aumentados en los 12 niños con SUH. Resultados similares fueron publicados por Takahashi y col15 y por Monteagudo y col16, en la mayoría de los casos en adultos con la forma esporádica de SUH y PTT. El estudio que presentamos aquí es el más numeroso en niños con SUH epidémico a los que se le midió marcadores de activación de trombina. Los niveles de F1+2 en estos niños con SUH se encontraron dentro del rango hallado en adultos con PTT, mientras que los niveles de TAT fueron más altos que aquellos encontrados en PTT15, 16 y en sujetos normales después de la infusión de endotoxina34. Es interesante remarcar que se encontraron correlación estadística entre los valores de F1+2 y TAT comparados con los marcadores de laboratorio de insuficiencia renal, urea y creatinina séricas, y estas correlaciones se mantuvieron a lo largo de estudios repetidos durante la enfermedad hasta la remisión, sugiriendo la existencia de un desencadenante común para las alteraciones hemos-táticas y renales. La activación de la coagulación pudo producir depósitos de fibrina en la microcirculación renal dando lugar a insuficiencia renal. López y col9 encontraron altos niveles de TNF-a en la mayoría de los niños con SUH. De todas maneras, y en concordancia con los resultados de Fitzpatrick y col14, nosotros encontramos aumento de los niveles de TNF-a sólo en 5 niños de los 12 estudiados, 4 de los cuales recibieron 3 diálisis peritoneales cada uno y el otro recibió 9. De todas maneras, no se encontró correlación entre los niveles de TNF-a y el número de diálisis peritoneales ni los datos clínicos y de laboratorio. En niños con púrpura por infección severa, los niveles de TNF-a fueron significativa-mente más altos que en aquellos detectados en los casos con SUH28. Se creía que el TNF-a estaba involucrado en la activación de la coagulación por inducción de la expresión de factor tisular sobre las células endoteliales en cultivo24, 25.
Además, se encontraron niveles aumentados de los marcadores de activación de la coagulación29 después de la infusión de TnF-a en sujetos normales, pero se demostró recientemente que la IL-6 es en realidad la citoquina que induce activación de la coagulación26 mientras que el TNF-a parece estar involucrado con la activación de la fibrinolisis27.
El factor von Willebrand es un reactante de fase aguda y aumentó después de la infusión de TNF-a en humanos35. Sin embargo, estudios posteriores han demostrado que la IL-6 es una citoquina proinflamatoria responsable de la inducción de la síntesis de reactantes de fase aguda36. Por otro lado, el TNF-a y la IL-1 son inductores de la síntesis y liberación por parte de los monocitos y de las células endoteliales de iL-637. Encontramos niveles aumentados de TNF-a en el 41% de los niños con SUH mientras que el 96.6% de ellos tuvieron aumento de los niveles de FvW, por lo tanto, deberían determinarse los niveles de IL-6 para dilucidar estos hallazgos. Pero también otros mecanismos tales como Shiga toxinas podrían cumplir un rol en este fenómeno19. En contraste, Wada y col38 encontraron niveles normales de FvW en adultos con PTT. La correlación significa que nosotros encontramos entre el FvW y los niveles de F1+2 y TAT da fundamento para la hipótesis de la activación de células endoteliales. Se han descripto extensamente en pacientes con síndrome de microangio-patía hemolítica anormalidades moleculares y funcionales del FvW39, 40.
El recuento plaquetario correlacionó con uno de los marcadores de generación de trombina, el F1+2, y con la creatinina y urea séricas. Estos datos indican interacciones complejas sugiriendo que la disminución en el recuento plaquetario podría ser secundaria a la generación de trombina o a la activación y/o daño endotelial por parte de las verocitotoxinas y/o citoquinas.
En conclusión, este grupo de niños con cuadro clínico de SUH epidémico presentaron generación de trombina evidenciado por los niveles aumentados de F1+2 y TAT. Más aún, la correlación encontrada entre estos marcadores, así como los niveles de FvW y el recuento de plaquetas con los de cretinina y urea sérica sugieren que estos pueden ser secundarios a un mismo estímulo sobre células endoteliales por parte de citoquinas tales como TNF-a e IL-6, y/o verocitotoxinas, pero no podemos descartar la participación de otros factores aún poco conocidos.

Agradecimientos: Estos estudios han sido llevados a cabo con subsidios del Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET) y de la Universidad de Buenos Aires. Queremos agradecer a Lic. Susana Laguna por su asesoramiento en el análisis estadístico.

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TABLA 1.- Correlación entre los ensayos hemostáticos y la creatinina y urea séricas en niños con síndrome urémico hemolítico epidémico

TAT F1+2 FvW Recuento plaquetario
(ng/ml) (nM) (%) (x1.000/µl)

TAT r=0.36 r=0.41 r=-0.21
(ng/ml) - p<0.025 p<0.01 NS
F1+2 r=0.36 r=0.77 r=-0.64
(nM) p>0.025 - p<0.001 p<0.001
Urea sérica r=0.59 r=0.66 r=0.65 r=-0.71
(g/l) p<0.001 p<0.001 p<0.001 p<0.001
Creatinina r=0.77 r=0.57 r=0.59 r=-0.52
sérica p<0.001 p<0.001 p<0.001 0<0.001
(mg/dl)

Fig. 1.- Niveles de TAT (A) y F1+2 (B) en las distintas muestras determinados por técnica de ELISA en niños con SUH. 1, muestra obtenida al ingreso; 2, una semana después; 3, dos semanas después; 4, convalecencia. El rango normal es el área entre la abcisa y la línea horizontal justo sobre ella.
Fig. 2.- Niveles de FvW medidos por técnica de Laurell. El rango normal se indica con una línea vertical cerca del eje de las ordenadas. Las muestras fueron obtenidas en los misoms tiempos indicados en la Fig. 1.