QUIMIOKINAS Y SUS RECEPTORES

DOS NUEVOS ACTORES EN LA FISIOPATOLOGIA DE LA INFECCION POR HIV

RAUL E. DAVARO1, EDGARDO BOTTARO2

1 Memorial Health Care and University of Massachusetts, Worcester, MA, USA;
2 Medicina Integral Metropolitana, Buenos Aires

Key words: HIV, chemokines, co-receptors

Resumen

El reciente descubrimiento de dos nuevos co-receptores utilizados por el HIV-1 para la penetración de células blanco permite una mejor comprensión de los mecanismos de interacción virus-huésped. El concomitante descubrimiento de que estos receptores son utilizados por quimiokinas allana aún más el camino en la interpretación de la biología molecular y la fisiopatología de la infección por HIV. Estos hallazgos permiten planear nuevas estrategias terapéuticas destinadas a bloquear la interacción virus-receptor.

Abstract

Chemokines and their receptors. Two new actors in the physiopathology of HIV infection. The discovery of two novel structures (CXCR4, CCR5) that act as HIV-1 coreceptors in target cells has allowed a better understanding of the virus-cell interaction. The recent discovery that chemokines interact with the same receptors as HIV-1 has shed light in the comprehension of the viral molecular biology and pathophysiology, setting the stage for new efforts aimed at blocking virus-cell interaction.

Dirección postal: Dr. Edgardo Bottaro, Miranda 4402 9° A - 1407 - Buenos Aires

Recibido: 21-V-1997 Aceptado: 24-VII-1997

En los últimos meses se han producido numerosos avances en la comprensión de la biología molecular del HIV (virus de la inmunodeficiencia humana). Técnicas novedosas permiten cuantificar al virus en plasma1-3, nuevas drogas disminuyen la replicación de manera importante4, y un modelo matemático permite identificar diferentes poblaciones virales5 con una muy alta capacidad de replicación6.
La reciente identificación de los receptores de las quimiokinas como cofactores para la penetración del HIV en linfocitos y macrófagos y la dilucidación de la estructura química y función de algunas qumimiokinas han permitido dar pasos muy importantes para comprender mejor los mecanismos de fusión y penetración viral como también explorar nuevas estrategias que permitan alternativas terapéuticas diferentes a las disponibles8.

El receptor CD4, primer receptor específico descubierto

Poco después del descubrimiento HIV, se descubrió que éste ingresaba a los macrófagos y linfocitos colaboradores (helper) a través del receptor CD49, 10. Rápidamente se observó que si bien el receptor CD4 era capital para la fusión y penetración viral, el mismo interactuaba con otras estructuras no identificadas en la membrana celular. Esto se comprobó realizando experiencias en células animales modificadas para expresar solamente el receptor humano CD4. El virus fracasaba en la penetración celular cuando estas células sólo expresaban dicho receptor11. Esto permitió hipotetizar que otros factores presentes en células humanas y ausentes en estas células híbridas eran necesarios para explicar el fenómeno de fusión y penetración celular12. Esto motivó la búsqueda de estructuras de membrana que permitieran dilucidar el mecanismo íntimo de penetración celular utilizado por el HIV.
Lo que sigue es una integración del conocimiento actual de la interacción virus-huésped y las hipótesis que esto permite formular.

Tropismo del HIV, un obstáculo para la interpretación del mecanismo de penetración

Un hecho que complicó la identificación de co-receptores que interactuaran con el CD4 es la existencia de cepas virales con tropismo in vitro por diferentes tipos celulares13. Esto sugería la existencia de penetración viral a través de receptores diferentes en tipos celulares diferentes, hecho confirmado por los recientes descubrimientos14.
Existen cepas del HIV con tropismo por células transformadas de linfocitos o monocitos, que se llaman cepas T-trópicas. Estas cepas inducen in vitro la formación de sincicios celulares entre las células infectadas (SI, en inglés syncitium inducing). Otras cepas del HIV presentan tropismo in vitro por macrófagos y linfocitos periféricos CD4 y se denominan M-trópicas, éstas no forman sincicios (NSI en inglés non synciciun induc- ing)15-18.
Cuando se trata de infectar macrófagos in vitro con cepas T-trópicas se fracasa, lo mismo ocurre con las cepas M-trópicas que fracasan al intentar penetrar linfocitos colaboradores. Este tropismo por diferentes tipos celulares de cepas del HIV in vitro sugiere la utilización de diferentes receptores para la fusión y penetración.
Como veremos abajo este fenómeno de tropismo viral in vitro tiene correlación in vivo ya que las cepas M-trópicas participan en la mayoría de los casos de trasmisión heterosexual19.
El tropismo viral por los diferentes tipos celulares es determinado por la región variable 3 (V3 loop) de la región gp 120 de la proteína de envoltura viral20.
En células del sistema nervioso central y en células colónicas Levy describió la galactosil-ceramida como cofactor necesario para la infección viral, y cuando el virus forma complejos con anticuerpos la penetración se produciría a través del receptor para la región Fc de las inmuno-globulinas21.
En síntesis la existencia de cepas virales con tropismo diferente permite inferir que existen diferentes vías de penetración en tipos celulares diversos.

Identificación casi simultánea de dos nuevos receptores

En el lapso de 40 días entre el 10 de mayo y el 20 de junio de 1996 dos grupos de investigadores trabajando en centros diferentes describieron dos tipos de receptores que participan en forma activa conjuntamente con el CD4 durante la fusión y penetración viral.
Feng et al,22 utilizando una ingeniosa técnica de clonación, describieron un receptor que asociado al CD4 en células humanas permitía la penetración del HIV, el receptor fue bautizado «Fusina» o LESTR (leukocyte-expressed seven-transmembrane-domain-receptor). Este receptor es utilizado por cepas T-trópicas del virus para penetrar en linfocitos helper y está constituido por 7 segmentos diferentes asociados a la proteína G. La síntesis del mismo está dirigida por un gen localizado en el cromosoma 223. Paxton et al por su parte describieron el receptor CCR 5 como co-receptor del CD4 para cepas M-trópicas del HIV24, 25. El gen que dirige la síntesis del receptor CCR5 se ha localizado en el cromosoma 3p2126. El receptor Fusina, ahora rebautizado CXCR4 y el receptor CCR5 se describieron en linfocitos y macrófagos respectivamente22, 24-25.
Dos nuevos receptores utilizados por las cepas HIV M-trópicas fueron descriptos inmediatamente después, el CCR-3 y el CCR-2b26, 27. Teleológicamente estos receptores interactúan con mensajeros químicos solubles denominados quimiokinas atrayendo glóbulos blancos a las áreas de inflamación. El nombre de «quimiokinas» se debe a que combinan la capacidad de generar quimioatracción y de actuar como citokinas28. Las quimiokinas son polipéptidos de 70 a 90 aminoácidos que se clasifican en alfa quimiokinas y beta quimiokinas29.
Químicamente las alfa quimiokinas también conocidas como CXC tienen un aminoácido entre los dos primeros residuos de cisteína y el gen que dirige su síntesis se encuentra en el cromosoma 4. Las beta quimiokinas o CC carecen de residuos de aminoácidos entre las dos primeras cisteínas. Estas pequeñas moléculas atraen diferentes tipos de leucocitos a los sitios de infección. Las alfa quimiokinas como la Interleukina 8 activan neutrófilos, y las beta quimiokinas activan linfocitos T, basófilos, eosinófilos, y macrófagos28.
Los receptores para las quimiokinas actúan ante señales muy diversas como catecolaminas y péptidos29. Estos receptores están asociados al sistema intracelular de la proteína G. La familia de los receptores asociados al sistema de la proteína G está constituida por numerosos miembros, entre ellos: los receptores a las catecola-minas, acetilcolina, dopamina, histamina, prosta-glandinas, péptidos como la vasopresina, ocito-cina y angiotensina, y proteínas como el glucagon y la tirotropina57. El receptor CXCR4 interactúa con la quimiokina SDF-1 (stromal cell-derived factor 1) cuya función es inducir proliferación de linfocitos B y reclutar linfocitos T30, 31. El receptor CCR5 interactúa con varias quimiokinas entre ellas RANTES (regulated-upon-activation normal T expressed and secreted), MIP-1 alfa (macrophage inflammatory protein 1 alpha), y MIP-1 beta (por macrophage inflammatory protein 1 beta) producidas por linfocitos CD824, 25. Es posible que estos receptores respondan no solo a estos sino también a otros estímulos químicos29.

Posible rol de las quimiokinas. Controversia no resuelta

Es interesante señalar que seis meses antes de la descripción de los 2 nuevos co-receptores, dos grupos de investigadores identificaron cuatro quimiokinas con capacidad supresiva de la replicación in vitro del HIV, por lo que la capacidad supresiva de las quimiokinas in vitro se conoció antes que los receptores sobre los cuales estas sustancias actuaban32. Cocchi et al33 publicaron que tres quimiokinas RANTES, MIP1-alfa y MIP-1 beta producidas por linfocitos CD8 jugaban un rol importante en el control de la replicación in vitro del HIV en células mononucleares periféricas. Baler et al34 a su vez identificaron que la interleukina-16 uniéndose al receptor CD4 producía por mecanismos desconocidos inhibición de la replicación del HIV24.
Poco después del descubrimiento del receptor CCR5 Moore y Koup24 armonizaron los hallazgos de la acción in vitro de las quimiokinas con el receptor CCR5. Estos investigadores observaron que las recientemente descriptas quimiokinas RANTES, MIP1-alfa, y MIP1-beta interferían en la unión de cepas de HIV M-trópico al receptor CCR5 ya que las quimiokinas y el HIV competirían por el mismo blanco.
El descubrimiento que las quimiokinas inhibían in vitro la penetración y posterior proliferación de cepas M-trópicas del HIV permitió formular varias hipótesis: 1) Zanussi35, y Clerici36 postularon que los pacientes infectados con HIV sin descenso de CD4 ni infecciones oportunistas luego de 7 años y que se clasifican como no progresores (Long term non progressors, LTNP) producían quimiokinas en mayor cantidad que los que presentan progresión más acelerada, lo que explicaría la evolución clínica más lenta de los primeros. Esta hipótesis no pudo ser demostrada dado que no se observó diferencia entre los no progresores y los que tuvieron progresión clínica en la producción media de quimiokinas; 2) Chen y Gupta37 corroboraron la capacidad de los linfocitos CD8 para producir las quimiokinas RANTES, MIP1-alfa, y MIP1-beta pero estas sustancias in vitro fracasaron en inhibir la infección de células T ; 3) Blazevic et al38, corroboraron los hallazgos de Chen y Gupta.
En suma, existen hallazgos que indican que las quimiokinas tienen la capacidad de bloquear la penetración y posterior replicación del HIV-1 a la célula blanco in vitro. Dependiendo del tipo de cepa viral estudiada este bloqueo puede oscilar entre un 7 a un 99%39, 40. No está claro el efecto que estas sustancias tienen in vivo al competir por los mismos receptores que el HIV.

Mecanismo de penetración

Descubiertos los nuevos receptores podemos comprender mejor el mecanismo de interacción, fusión y penetración del virus en células que poseen al receptor CD4 y la interacción de éste con los mismos. El HIV se une al receptor CD4 a través de una región de la proteína de envoltura, la región gp 12013. Posiblemente esta unión genera cambios conformacionales tanto en el receptor CD4 como en la región gp 120 de la envoltura viral21. Estos cambios aparentemente «expondrían» espacialmente regiones químicamente capaces de unirse al receptor CXCR4 en el caso de cepas T trópicas22. En el caso de cepas M trópicas el receptor utilizado sería el CCR524, 25. La proteína de envoltura del HIV tiene dos conspicuas regiones la gp 120 y la gp 4013. Una vez que el receptor CD4 y el CXCR4 o CCR5 interactúan con la región gp120 de la proteína de envoltura, la región gp 41 de esta proteína sufre cambios conforma-cionales54 e interactúa con regiones de la membrana plasmática produciéndose la fusión del virus a la célula y su posterior penetración21. En estos mecanismos postulados para la penetración del HIV se basan los conocimientos actuales, pero no explican la penetración en todos los diferentes tipos celulares afectados por el virus ni la interacción completa del virus con la célula huésped (Fig. 1).

Tropismo celular, vías de infección

Como expresamos anteriormente existen cepas virales con tropismo in vitro por diferentes tipos celulares15-18. Este hallazgo tiene connotaciones prácticas importantes. Las cepas que causan la mayor parte de la transmisión de la infección por vía heterosexual son las M-trópicas19, utilizan el receptor CCR5 y en menor medida el CCR3 como co-receptor del CD4 para fusionarse y penetrar en macrófagos y en linfocitos que tengan estos receptores41.
Las cepas T-trópicas infectan linfocitos T que poseen el receptor CD4 y el receptor para las quimiokinas alfa CXCR4. Existen aún receptores no identificados como se deduce de estudios in vitro41.
Existen cepas que pueden utilizar ambos receptores y también los receptores CCR-2b y CCR-326, 27. La desigual distribución de las diferentes cepas sugiere que es posible que la misma sea consecuencia de las diferentes vías de trasmisión predominante en cada una de ellas.
Existen diferentes genotipos de HIV que se clasifican de acuerdo a las secuencias de los genes env y gag42. El primero de los genes codifica las proteínas de la envoltura que median la unión y fusión con la membrana plasmática de la célula huésped. El gen gag codifica las proteínas de la nucleocápside13. Los subtipos se han clasificado con las letras del alfabeto latino de A a I. Los subtipos A, C y D predominan en el Africa subsahariana, el C en India y el E en Tailandia. El tipo B predomina en América y Europa. Estos nueve genotipos pertenecen al grupo M. Recientemente se ha descripto un nuevo grupo, el O, de aparente distribución predominante en Africa42. Esta diversidad genética tiene importancia médica pues existe evidencia suficiente que sustenta diferencias en la trasmisibilidad de las diferentes cepas.
Durante la infección por vía heterosexual con cepas M-trópicas se han propuesto las células de Langerhans (CL) como un posible blanco primario del HIV19. Estas células que expresan el receptor CD4 se encuentran en la mucosa oral y genital. Recientemente, se ha demostrado que el virus aislado de individuos infectados tailandeses (predominancia de Cepa E) tenía un mayor tropismo por las CL que el virus aislado de infectados homosexuales estadounidenses (Cepa B). Los autores proponen que el subtipo E que se trasmite por vía heterosexual tendría mejor adaptación a esta trasmisión que las cepas aisladas de los homosexuales (cepa B) que se trasmitiría más eficientemente por vía parenteral y homosexual que son las dos formas de trasmisión predominante en EEUU actualmente. Esto sin embargo no explica la aparente adaptación de la cepa B a la trasmisión heterosexual en América Latina donde ésta predomina en la trasmisión heterosexual.
En suma, existen diferentes genotipos virales con distribución geográfica predominante para cada uno de ellos que pueden ser consecuencia de una selección Darwiniana; a su vez, estos genotipos presentarían una forma de trasmisión predominante en las diferentes áreas que habitan.

Mutación de los receptores y protección contra la infección

Desde el comienzo de la epidemia y como en toda enfermedad infecciosa existen individuos que a pesar de haber sido expuestos al HIV no se han contagiado. El reciente descubrimiento de co-receptores para el HIV ha permitido demostrar que en algunos casos esto puede ser parcialmente explicado por modificaciones en los mismos. Samson et al44 descubrieron un alelo mutante del CCR5: el CCR5D 32 producto de una deleción de 32 pares de bases que resulta en la síntesis de un receptor no funcional resistente a la unión con cepas M-trópicas o a la infección por cepas con capacidad dual macrófago y linfocito-trópicas. Esta mutación es bastante frecuente en individuos caucásicos con una frecuencia de 1% para homocigosis y de 15 al 20% para heterocigosis. A pesar de esta alta prevalencia de homocigosis en estudios realizados en unos 3000 infectados no se encontraron individuos infectados homocigotas para esta mutación (CCR5D 32) en EEUU.
En tres individuos homocigotas para la deleción 32 del CCR5 recientemente descriptos, contrariamente a lo esperado se produjo infección por HIV, postulándose en este caso que la fusión y penetración se podrían haber producido por los receptores CCR1, CCR2, CCR3, o debido a la infección con una cepa T-trópica que utiliza el receptor CXCR445, 55, 56.
En un extenso estudio poblacional se cuantifi- có el polimorfismo del receptor CCR5 en 406 individuos HIV positivos y en 261 seronegativos. Los pacientes infectados por HIV, con expresión de defectos genéticos a nivel del gen para el receptor CCR-5 tuvieron una progresión más lenta y los no infectados una mayor protección contra la infección por el HIV a pesar de tener relaciones sexuales de alto riesgo. Esto señala un efecto «protector» producido por defectos en este receptor. Como señalamos anteriormente existen virus con tropismos por diferentes células que son infectadas a través de diferentes receptores. En este estudio, como era de esperar, los pacientes con cepas linfotrópicas (que utilizan el receptor CXCR4) no presentaron beneficios aparentes con mutaciones del receptor CCR546.
Paxton et al47 publicaron sus hallazgos en un grupo de 25 pacientes con antecedentes de conducta sexual de alto riesgo, definida ésta como relaciones sexuales con individuos infectados sin mediar protección. El estudio in vitro de los linfocitos CD4 de estos individuos mostró que los mismos eran menos susceptibles a la infección que los linfocitos CD4 de un grupo control. Los linfocitos CD8 de los pacientes menos susceptibles a la infección mostraron una mayor actividad de quimiokinas RANTES, MIP-1 alfa y MIP-1 beta. Sólo dos de estos 25 pacientes tenían cambios conformacionales a nivel del CCR5 que explicaban la disminución de la susceptibilidad a la infección.
En la Figura 2 se esquematizan dos vías de penetración diferentes utilizadas por cepas de virus T-trópico y M-trópico en células con receptores normales y en células con receptores CCR5 mutantes.

Bloqueo in vitro de la penetración viral. ¿Hacia nuevas alternativas terapéuticas?

Los últimos adelantos han impulsado líneas de investigación que tratan de bloquear la penetración del virus a través del bloqueo de receptores. Es necesario puntualizar que en el pasado el intento de bloquear la penetración del virus administrando receptor CD4 soluble no permitió alcanzar resultados terapéuticos útiles48, 49.
Simmons et al50 recientemente demostraron que la administración in vitro de la quimiokina RANTES modificada químicamente en su extremo amino terminal para brindarle una afinidad más alta por el receptor CCR5 inhibía la infección de macrófagos y linfocitos por cepas de HIV M-trópico. Esto brinda pistas para explorar las potencialidades terapéuticas de esta sustancia o sustancias similares. Las cepas M-trópicas estarían involucradas en el 90% de la trasmisión heterosexual, en consecuencia el receptor CCR5 sería muy importante en el comienzo y establecimiento de la infección50.
Seisdedos-Arenzana et al51 modificaron químicamente la quimiokina RANTES eliminando los primeros ocho aminoácidos de la misma. Esto se tradujo en pérdida de la capacidad quimiotáctica y de la capacidad de activar leucocitos. Esta proteína modificada mostró una alta afinidad por el receptor CCR5 bloqueando la penetración in vitro de cepas M-trópicas de VIH.
Si bien estos dos equipos han logrado demostrar la utilidad in vitro de estas quimiokinas modificadas químicamente la aplicación de estos principios in vivo presenta aún numerosos obstáculos. Es necesario lograr el desarrollo de quimiokinas modificadas que posean únicamente la capacidad bloqueante de los receptores sin ninguna de las otras propiedades que las caracterizan.
En suma, el descubrimiento de dos nuevos co-receptores del CD4, la mejor comprensión de la acción de algunas quimiokinas, la modificación química de las mismas para bloquear la fusión y penetración viral y la dilucidación de modificaciones genéticas de los receptores que permiten explicar la disminución de la susceptibilidad de algunos individuos al HIV, son parte de los hallazgos recientes que permiten abrir nuevas vías de investigación en la comprensión de la biología molecular del virus, su interacción con el huésped y las alternativas terapéuticas futuras.52, 53.

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Fig. 1.- Interacción entre la proteína de envoltura viral a través de sus dos subunidades con el receptor CD 4 y los co-receptores CCR5 y CXCR4 (en este último caso dependiendo del tipo de célula T-trópica o M-trópica respectivamente). El péptido de fusión es una estructura de la membrana de la célula blanco que se une a la subunidad gp 41 de la proteína de envoltura viral, esta interacción es seguida por la penetración del core viral21, 50.
Fig. 2.- Interacción entre los diferentes tipos de virus M-trópico o T-trópico con los diferentes sub-tipos de receptores Fusina (CXCR4) o CCR5 respectivamente. En el esquema inferior se observa la consecuencia de la mutación del receptor CCR5, esta mutación no modifica la interacción con el receptor a la Fusina.