OXIDO NITRICO, INFLAMACION Y CELULAS FAGOCITICAS

Coordinadora:Dra. MM Bracco

1. Los neutrófilos humanos son células productoras de óxido nítrico y peroxinitrito. María Cecilia Carreras, N. Riobó, G.A. Pargament, J.J. Poderoso.
Laboratorio de Metabolismo del Oxígeno, Hospital de Clínicas José de San Martín, Universidad de Buenos Aires.

Previamente hemos demostrado que los neutrófilos humanos (PMN) producen óxido nítrico (NO) en reposo y tras la estimulación con agentes quimiotácticos (fMLP) o ésteres del forbol (PMA) (FEBS Lett. 341:65, 1994). La producción simultánea de NO y anión superóxido (O2-) durante el estallido respiratorio conduce a la formación de anión peroxinitrito (ONOO-), un poderoso oxidante responsable de la nitración de proteínas intra y extracelulares como la albúmina, proteínas mitocondriales y enzimas como la superóxido dismutasa produciendo cambios en su estructura y función. Hemos analizado la cinética de este proceso mediante el uso de inhibidores de la síntesis de NO y superóxido dismutasa lo cual nos ha permitido estudiar la contribución relativa de ambos compuestos (1 NO/5 O2-). La formación de peroxinitrito con una constante de 6.9 x 109 M-1s-1 dificulta la observación del metabolismo de NO en el neutrófilo, especialmente en ausencia de atrapadores del NO, lo que ha producido algunas divergencias con respecto a su producción por los neutrófilos humanos. La NADPH oxidasa y la NO sintasa comparten algunos caminos de transducción de señales para su activación e inactivación, ambas son activadas vía proteína quinasa C e inactivadas vía proteína quinasa A, pero la activación de tirosina quinasas produce la inactivación de la NO sintasa (Free Rad.Res. 26: 325, 1997). Esta disociación podría ser importante en la regulación del mecanismo de muerte celular programada de los PMN. En este sentido, hemos visto evidencias sobre la participación del NO sobre la apoptosis espontánea de los leucocitos polimorfonucleares. Los neutrófilos humanos pueden expresar NO sintasas (NOS) de tipo constitutivo e inducible. Recientemente, hemos observado la presencia de RNA mensajero de la NOS neuronal, el cual podría estar modificado en algunas patologías como la enfermedad de Parkinson, donde hemos detectado un aumento significativo de su expresi? que se acompa? con el aumento de la velocidad de producci? de NO por estas c?ulas activadas con PMA (Mov.Disord. 11: 261, 1996). Esta condici? favorece la formaci? de peroxinitrito y la nitraci? de prote?as en los neutr?ilos que podr? explicar modificaciones en la transducci? de se?les intracelular en diversas patolog?s.

2. Modulación de la actividad citotóxica de los granulocitos neutrófilos por óxido nítrico (NO). Graciela Andonegui, A. Trevani, M. Giordano, J.Geffner.
Instituto de Investigaciones Hematológicas, Academia Nacional de Medicina, Buenos Aires

Los granulocitos neutrófilos desarrollan su actividad inflamatoria en ambientes en los cuales se producen cantidades variables de NO, a expensas de NO sintasas (NOS) constitutivas y/o inducibles expresadas por diferentes tipos celulares. Nuestro objetivo básico consistió en evaluar “in vivo” e “in vitro”, el impacto del NO sobre la fisiología del granulocito neutrófilo. En experiencias desarrolladas en ratones Balb/c, observamos que los inhibidores de NOS (L-NAME o L-NNA, 50 mg/kg peso, una dosis) indujeron: a) una marcada neutrofilia, con pico a las 4 horas post-tratamiento y b) un notorio incremento en la adherencia de los neutrófilos al endotelio, de acuerdo a observaciones realizadas en cortes de pulmón. Ambos efectos fueron prevenidos por tratamiento simultáneo con L-arginina (250 mg/kg). No obstante, los inhibidores de NOS no fueron capaces de potenciar el reclutamiento de neutrófilos en pulmón, en respuesta a la instilación intratraqueal de agentes inflamógenos tales como el fMLP (J.Leuk.Biol. 58:391,1995). En un segundo grupo de experiencias analizamos el impacto del NO sobre la actividad citotóxica de los neutrófilos humanos. A tal efecto examinamos dos tipos diferentes de respuestas: la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (CCDA) y las respuestas citotóxicas oxígeno-dependientes (inhibibles por catalasa) gatilladas por complejos inmunes y fMLP. Empleando como agentes dadores de NO el GSNO y el SNAP encontramos, en relación a la CCDA, una acción moduladora bifásica. Un efecto inhibitorio fue observado al emplear células blanco recubiertas por altas concentraciones de anticuerpos, mientras que un efecto amplificador fue observado empleando bajas concentraciones de anticuerpos. Ambos efectos fueron reproducidos por análogos del GMPc (Inmunología. 86: 646, 1995). En relación a la CCOx observamos una notoria actividad exacerbadora mediada por el NO, no reproducible por análogos del GMPc, asociada a: 1) un incremento en la producción de anión superóxido y peróxido de hidrógeno, 2) un incremento en la liberación de la enzima mieloperoxidasa (MPO) y 3) un “switch” en el mecanismo citotóxico desde una vía MPO-independiente a otra MPO-dependiente. Estos resultados indican que el NO es capaz de modular la actividad citotóxica de los granulocitos neutrófilos. El sentido de tal modulación así como también los mecanismos subyacentes a la misma se muestran dependientes de la función citotóxica analizada y de las propiedades del estímulo empleado.

3. El óxido nítrico induce apoptosis en los macrófagos. Eduardo G Lapetina.
Molecular Cardiovascular Research Center, Case Western Reserve University School of Medicine, Cleveland, Ohio 44106-4958, USA.

Los macr?agos juegan un papel muy importante en la respuesta inflamatoria del ser humano y responden a las mol?ulas que median inflamaci? como las citoquinas y los factores de crecimiento; asimismo, determinadas citoquinas son producidas por los macr?agos. El balance entre los macr?agos que acuden al foco inflamatorio y los que se destruyen es cr?ica para la resoluci? de la inflamaci?. Los macr?agos mueren por fen?enos de apoptosis, principalmente por la acci? de ?ido n?rico (NO); el NO tiene dos orígenes: el primero, por el aumento de expresión y actividad por estimulación de la enzima NO-sintetasa (NOS inducible) del macrófago y el segundo es aquel producido de forma exógena por células adyacentes o compuestos que liberan NO. El propósito de este estudio es la determinación de los mecanismos asociados a la apoptosis de macrófagos producida por el NO. Para ello utilizamos una línea de macrófagos que son sensibles a la apoptosis producida por el NO endógeno y una variante clonal de la primera caracterizada por ser resistente al NO producido por células estimuladas con lipopolisacaridos e interferon-gamma. Paradójicamente, estas células resistentes al NO endógeno son muy sensibles al NO producido en forma exógena. Estas diferencias fenotípicas permiten delimitar los mecanismos bioquímicos que controlan la apoptosis y la resistencia a la apoptosis de los macrófagos. En el foco inflamatorio hay un porcentaje de macrófagos que son resistentes a la apoptosis y contribuyen a perpetuar la inflamación. La identificación de los fenómenos moleculares que producen resistencia a la apoptosis pueden llevar a obtener fármacos que modulen la inflamación. Los resultados que hemos obtenido que definen los mecanismos de apoptosis y la resistencia a la apoptosis serán discutidos durante esta presentación.

4. Rol del óxido nítrico (NO) en la fisiopatología de la falla contráctil del músculo diafragmático en la sepsis. J. Boczkowski, C. Lisdero, S. Lanone, M.C. Carreras, A. Boveris, M. Aubier, J.J. Poderoso.
INSERM U408, Paris, Francia; Laboratorio de Metabolismo del Oxígeno, Hospital de Clínicas José de San Martín, Universidad de Buenos Aires.

La aparición de insuficiencia respiratoria durante las infecciones sistémicas (sepsis) es frecuente y condiciona el pronóstico de los pacientes. Una alteración de la contractilidad del diafragma, ha sido demostrada como un elemento clave en la génesis de la insuficiencia respiratoria durante la sepsis (Am. Rev. Respir.Dis.198: 260, 1988; 142: 193, 1990). El objetivo de nuestro trabajo es investigar el rol del NO en la fisiopatología de la disfunción diafragmática en la sepsis. En una primera serie de estudios en ratas inoculadas con endotoxina de Escherichia coli, hemos observado que el NO sintetizado por la NO sintasa inducible (NOS2) expresada en los miocitos diafragmáticos, es un mediador de la alteración de la contractilidad diafragmática (J.Clin.Invest. 98: 1550, 1996). En una segunda serie de estudios hemos investigado el mecanismo de este efecto del NO, tomando como eje su acción sobre la respiración mitocondrial. Los resultados obtenidos en ratas sépticas muestran que el NO sintetizado por la NOS2 diafragmática aumenta la formación mitocondrial de anión super?ido, que se combina con el NO para generar peroxinitrito. El peroxinitrito es el mediador del efecto del NO ya que produce la nitraci? las prote?as mitocondriales, lo que produce el desacoplamiento de la fosforilaci? oxidativa mitocondrial y la falla contr?til muscular. Finalmente, en una tercera serie de estudios, hemos evaluado la expresi? de la NOS2 en el diafragma humano. En estos trabajos, utilizando muestras musculares obtenidas a partir de autopsias de pacientes fallecidos de shock séptico, hemos confirmado la expresión de una NOS2 funcional en miocitos del diafragma y también del miocardio de ventrículo izquierdo. La expresión de la NOS2 esta asociada a la formación intramuscular de peroxinitrito. Hemos encontrado resultados similares en el músculo recto mayor, obtenido durante laparotomía o toracotomía de pacientes sépticos. La intensidad de la expresión de la NOS2 está directamente correlacionada a la gravedad del estado séptico. Estos resultados muestran que el NO juega un rol en la fisiopatología de la falla contráctil de los músculos respiratorios en la sepsis, y sientan por ende, nuevas bases terapeúticas para tratar esta afección