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RESUMENES DE LAS COMUNICACIONES EN POSTERS
REPRODUCCION I 370. Anomalías en el desarrollo embrionario temprano luego de
la ingesta crónica de alcohol por hembras de ratón. Elisa Cebral,
Andrea Lasserre, Valeria Rettori y Martha Gimeno. La pérdida embrionaria precoz es uno de los factores limitantes de la fecundación en humanos. Se vio que la ingesta crónica de etanol durante la gestación produce el sindrome de alcoholismo fetal en humanos (FAS). En este trabajo se estudió la influencia del consumo crónico de etanol materno en el desarrollo del embrión preimplantativo. Hembras murinas prepúberes recibieron etanol al 10% (m/v) en el agua de bebida por 30 días (HE) y los controles agua isocalórica con dextrosa (HC). Al día 27 se indujo la ovulación con PMSG y hCG, se ensayó la fecundación in vitro y los embriones se cultivaron 7 días. Para el desarrollo in vivo, las hembras se aparearon con machos controles. En el desarrollo in vitro de las HE disminuyó el % (p<0.05 a p<0.01) de embriones de 2-células (HE:61±4.2 vs HC:79.1±3.3, n:8), de 4-células (34.2 vs 64.1±3.0) y de mórulas compactadas (26.0±5.0 vs 71.0±4.5). En las HE, se redujo el % de blastocistos iniciales (5.4±1.6 vs 36.2±4.6) y expandidos (1.4±0.7 vs 19.0±2.7), con altos % de anomalías morfológicas (12.6±4.5 vs 4.7±1.2). Se vio escaso desarrollo in vivo de mórulas (15.3±9.0 vs 67.4±3.2) y alta fragmentación al día 4 (24.4±7.1 vs 5.3±3.5). Las anomalías morfológicas fueron similares a las in vitro. Concluimos que la ingesta crónica de alcohol por las hembras, resulta en una detención del desarrollo embrionario temprano, alteraciones morfológicas y aumento de fragmentación. Estos resultados apoyan las observaciones clínicas que muestran un porcentaje incrementado de abortos espontáneos en mujeres consumidoras de alcohol.
371. Efectos de interferon gamma (IFN-g) sobre el desarrollo de
embriones murinos in vitro. 1M Cameo, 1V Fontana, 1P Cameo, 2L
Vauthay, 3 M Tesone El efecto embriotóxico de sueros de pacientes con algunas patologías reproductivas, fue descripto por diferentes autores. La correlación entre dicho efecto y la producción de IFN-g, sugiere que éste es un responsable de la embriotoxicidad. La detección de embriotoxinas en sueros se realiza cultivando embriones de ratón de 2 células hasta blastocisto en presencia de los mismos. Para investigar si el IFN-g está involucrado en la embriotoxicidad, estudiamos el efecto del agregado de IFN-g exógeno al medio de cultivo sobre el desarrollo embrionario murino. Se cultivaron embriones de ratón de 2 células en presencia de suero humano control (10%) con (n=130) o sin (n=100) el agregado de hIFN-g (10µg/ml) a tres tiempos distintos (día 0, 3 y 5). Todos los ensayos se realizaron por duplicado. Se evaluó la proporción de blastocistos, attachment y spreading de los trofoblastos y se calcularon las medias de los % ± SEM. Los datos se evaluaron por ANOVA o X2. El agregado de IFN-g no produjo una diferencia significativa en el % de blastocistos y en el de attachment comparados con sus controles. La presencia de IFN-g alteró significativa-mente el spreading del trofoblasto a los 7 días de cultivo respecto al control (agregado en el día 0: 0% vs 68±16%; en el día 3: 16± 12% vs. 68± 16%; en el día 5: 7±7% vs. 68±16%). Se concluye que: IFNg tiene efecto embriotóxico sobre el desarrollo de embriones murinos in vitro; 7 días de cultivo permiten detectar efectos embriotóxicos no observables a 3 días utilizados rutinariamente en ensayos de embriotoxicidad.
372. Efecto de endotoxinas sobre desarrollo embrionario
temprano. P Saragueta, C Otto, R Schultz. Modificaciones génicas producidas por infecciones bacterianas podrían causar efectos directos sobre el desarrollo embrionario temprano, es de sumo interés el estudio de los efectos de bajas concentraciones (no tóxicas) de lipopolisacáridos (LPS). Por otra parte, el porcentaje de blastocistos obtenidos de cultivos in vitro es considerablemente menor a los desarrollados in vivo. La presencia de endotoxinas podría ser una de las causas de estos efectos. Para estudiar el efecto de LPS bacterianos sobre el desarrollo embrionario preimplantatorio en ratón, se ensayaron concentraciones crecientes de LPS (5 ng/ml-5µg/ml) desde el estadío de 2 células al de blastocisto. El efecto del tratamiento fue evaluado por los cambios morfológicos y la viabilidad durante el cultivo, observándose un efecto bifásico (0: 93%, 50 ng/ml: 50.1%, 500 ng/ml: 75.9% 50 mg/ml: 34.4% de blast). A su vez se evaluaron por RT-PCR semicuantitativa, los niveles de mensajeros de enzimas involucradas en la detoxificación de especies generadas por stress oxidativo. Los niveles de mRNA de las enzimas MnSOD y CuSOD (50 ng/ml: 58%, 500 ng/ml: 42% del control) correlacionaron con los cambios observados en el desarrollo, no ocurrió lo mismo con las enzimas involucradas en la generación de glutation reducido (GSH). Tratamientos con 50-100-500 ng/ml de LPS indujeron la expresión de TNF-a. Con el objetivo de localizar receptores de LPS se realizaron ensayos de unión y competencia de LPS marcado con lectinas fluorescentes (FITC-LPS) registrados por microscopía confocal. Conclusión: a) Se detectó efecto de LPS sobre el desarrollo y b) la expresión de enzimas involucradas en detoxificación así como del factor TNF-a c) Se comprobó la presencia de receptores específicos para LPS en embriones de ratón durante el período preimplantatorio
373. Actividad funcional de espermatozoides epididimarios de
ratón sometidos a administración pre o postnatal de etanol. JM
Busso, G Stutz, RD Ruiz, JL Lacuara Dado que etanol (E) es frecuentemente consumido por el hombre y se lo considera deletéreo sobre las funciones reproductoras, nos propusimos determinar los efectos de dosis equivalentes a las habituales en etilistas importantes, sobre motilidad, vitalidad, resistencia al shock hipoosmótico, reacción acrosomal (RA) e índice de fertilización in vitro en espermatozoides de ratones Albino swiss adultos. Se administró (i.p.) E: 0.87 g/Kg/día (E1) ó 1.20 g/Kg/día (E2) a machos durante 35 (A) ó 60 días (B) y a hembras durante los días 5-18 de la gestación (C); los controles recibieron solo el vehículo (Cl Na isotónico). Se evaluaron también los efectos de la adición in vitro del principal metabolito endógeno, acetaldehído (AC) (0.125, 0.25 y 1 mM). En A, B y crías adultas de C no se observaron diferencias con sus controles, salvo incremento del porcentaje de gametas no progresivas en A-E2 (Control 5.75± 0.79, n=24; A-E1 5.92±1.10, n=12; A-E2 12.27±2.37, n=11; p<0.05) y del porcentaje de RA con AC 1 mM (concentración sólo alcanzable en modelos experimentales). Estos resultados concuerdan con estudios previos que, aún con dosis superiores, informan fenómenos de reversibilidad espontánea y sustentan la idea de que en general la infertilidad obedece a causas multifactoriales y sólo excepcionalmente puede atribuirse a una variable única. Trabajo incluido en el PRIDRAH-CONICET.
374. Comparación de la eficacia de glicerol y etilenglicol para
la crioprotección de espermatozoides electroeyaculados de Chinchilla
laniger. R Carrascosa, AC Martini, MF Ponzio, M Fiol de Cuneo, RD
Ruiz, AA Ponce Hasta el presente, dentro de los componentes del medio crioprotector de las gametas, glicerol (Gl) es más frecuentemente usado que etilenglicol (Et). El objetivo de este estudio fue comparar la eficacia de ambas amidas (1M) para la criopreservación de espermatozoides electroeyaculados de Chinchilla almacenados a 4°C durante 24 ó 72 h en medio TES-Tris-Yema de huevo. Se determinaron porcentajes de gametas móviles (M; Cámara de Makler), vivas (V, tinción con H258) ó reactivas e íntegras al shock hipoosmótico (PRO, incubación en solución citrato-fructosa, 100 mOsm). A las 24 h, M y PRO disminuyeron significativamente en presencia de Gl con respecto a Et (M: 85.9±2.1 y 92.4±1.8; n=8; p<0.05. PRO: 62.9 ±3.6 y 69.1±4.7; n=6; p<0.05, para Gl y Et respectivamente. A las 72 h, en PRO y V se detectó un fenómeno similar (PRO: 38.8±8.5 y 54.6±7.0; n=5; p<0.05. V:66.2±10.7 y 82.0±8.4; n=7; p<0.05, para Gl y Et respectivamente). De los resultados expuestos puede inferirse que en Chinchilla Laniger: a) el almacenamiento a 4°C es un recurso económico que conserva durante plazos considerables la actividad funcional espermática; b) Et añadido al medio criopotector es más eficaz que Gl, al menos cuando las gametas son enfriadas, sin llegar al punto de congelamiento. Subsidiado por CONICET, CONICOR y SECyT-UNC e incluido en el PRIDRAH-CONICET.
375. Efectos de una suplementación dietaria con ácidos grasos
de la serie n3 sobre la fisiología y capacidad fertilizante de
ratones. ME Santillán, RD Ruiz, LM Vincenti, AA Ponce, JL Lacuara Comparamos los efectos de una dieta suplementada con derivados de ácido alfa linolénico (LN, 18:3n-3) vs otra deficiente en ácidos grasos esenciales (DAGE), suministradas a ratones macho Albino swiss desde el destete durante 2 a 6 meses, sobre la concentración (C), motilidad (M), vitalidad (V), respuesta al shock hipoosmótico, integridad del acrosoma (IA), índice de fertilización in vivo (FIVO) e in vitro (FIV). El componente lipídico de LN fue aceite de hígado de bacalao y el de DAGE fue oleina (18:1n-9). Asimismo se evaluó el efecto de una dieta a la que se agregó, en una proporción 1:1 (v/v), aceite de hígado de bacalao y oleína (LNO). Un lote control recibió alimento comercial (COM). Los parámetros evaluados para describir la fisiología espermática no mostraron diferencias significativas en ninguno de los grupos. La FIV disminuyó significativamente en LN y DAGE en todos los períodos vs LNO y COM. La FIVO fue decreciendo gradualmente en LN, siendo significativas las diferencias vs los otros 3 grupos a partir de los 3 meses, hasta alcanzar valores del 16% a los 6 meses. IA fue significativamente inferior (p<0.05) en LN, con respecto a todos los otros grupos, desde los 2 a los 5 meses. Los resultados sugieren que el aporte de LN en forma exclusiva puede tener efectos más deletéreos sobre la capacidad reproductiva que la deprivación total de ácidos grasos esenciales. Subsidiado por CONICET, CONICOR y SECyT-UNC e incluido en PRIDRAH -CONICET.
376. Modificaciones inducidas por progesterona y pentoxifilina
en algunos parámetros funcionales de espermatozoides bovinos. LM
Vincenti, JM Sad Larcher, M Fiol de Cuneo, RD Ruiz, AA Ponce Capacitación, motilidad hiperactivada y reacción acrosomal son procesos esenciales para que el espermatozoide adquiera capacidad fertilizante. Estos eventos pueden ser reproducidos in vitro por adición de agentes fisiológicos o farmacológicos. Se investigaron en espermatozoides bovinos descongelados los efectos de pentoxifilina (PX) 5mM (4h de incubación) y progesterona (P4) 10µM, (20 min post-capacitación) sobre el porcentaje de gametas móviles (M), vivas (V) ó con acrosoma reaccionado (AR). PX provocó una disminución significativa de M y V (p<0.05), mientras que P4 no modificó estos parámetros. La adición de P4, PX ó P4 + PX, aumentó significativamente RA (23.00±4.02, 20.57±2.68 y 20.94±2.13, respectivamente) respecto al control (11.21±1.55), (n=8 en todos los grupos). La disminución de M y V provocada por PX podría deberse a que el aumento de AMPc intracelular modifica el metabolismo, llevando al agotamiento celular. El aumento de RA provocado por P4 y PX, indica que las gametas se encuentran capacitadas luego de las 4 h de incubación y sugiere que los agentes empleados actúan como inductores o moduladores de este fenómeno. Subsidiado por CONICET, CONICOR y SECyT-UNC e incluido en el PRIDRAH-CONICET.
377. Efectos de señales fisiologicas sobre la actividad
funcional de espermatozoides bovinos criopreservados. LM Vincenti, M
Fiol de Cuneo, AA Ponce, AC Martini, JJ Calvete* A fin de determinar las posibles influencias ejercidas por agentes normalmente presentes en los microambientes a que son expuestos los espermatozoides previamente a la fecundación se investigaron, en gametas bovinas criopreservadas, los efectos de PDC-109 (espermadesina plasmática bovina) y una fracción de fluido folicular homólogo (FFb2, obtenido por elución en columna de Sephacryl HR-500). Se evaluaron los porcentajes de gametas móviles (M), vivas (V) y con reacción acrosomal (RA). Luego de descongelados, los espermatozoides fueron incubados en medio de Tyrode modificado (BSA 3 mg/ml y heparina 10 µg/ml) para su capacitación. Se realizó una curva concentración-respuesta no acumulativa a PDC-109 (0.1, 0.5, 1.5 ó 3 mg/ml) adicionada durante las 4 h de capacitación. V y M disminuyeron y RA aumentó significativamente (control: 13.1±0.1 vs 26.7±6.0; 28.4±4.1; 22.8±4.1 y 29.1±6.5 % respectivamente, n=7, p<0.05). En presencia de PDC-109 (1.5 mg/ml), FFb2 (1 mg/ml, 20 min post-capacitación) disminuyó significativamente los porcentajes de gametas móviles y progresivas; mientras que 0.5 y 1 mg/ml redujeron V; no se detectaron efectos de FFb2 sobre RA. La unión de PDC-109 a la membrana espermática y el secuestro de lípidos que se le atribuye, explicarían los efectos de la espermadesina sobre los parámetros descriptos. Se requieren estudios adicionales de distintas fracciones de FFb, para detectar la presencia de moduladores de la actividad funcional espermática. Subsidiado por CONICET, CONICOR, SECyT-UNC e incluido en el PRIDRAH-CONICET.
378. Efecto del antioxidante a-tocoferol en el manejo in-vitro
del espermatozoide. A Caille, MJ Munuce, F Pauluzzi El espermatozoide humano (S) genera especies oxígeno reactivas (ROS) que, a través de la peroxidación de lípidos (LP), afectan su membrana plasmática. El antioxidante a-tocoferol (a-T) capta radicales generados durante la acción de ROS. Se evalúa la efectividad del a-T en la LP y en la generación de ROS durante el manejo in vitro del S. Se trabajó con S lavados de muestras normozoospérmicas y <1.106 leucocitos/ml (n=19). A alícuotas de cada muestra, con o sin a-T (10 mM), se amplificó LP agregando Fe++/Ascorbato (FA). Se evaluó LP y ROS mediante: test del ácido tiobarbitúrico y sonda luminol. No se observó diferencia significativa entre medias de LP ni al adicionar a-T, ni con inducción con FA. En presencia de a-T, el efecto de FA en LP disminuyó 8 veces en las 10 muestras que respondieron a dicha inducción. La generación de ROS luego de incubar 1h aumentó 640% respecto de su valor en el semen (p<0.001), mientras que en presencia de a-T aumentó 220%. El uso del a-T no disminuye significativamente la LP durante el manejo in-vitro del S, ni la producción de ROS. La cantidad de ROS generadas sería independiente de LP. En conclusión, los resultados indican un efecto antioxidante moderado del a-T dependiente de las características de la muestra. Financ. PLACIRH PLI-266/96
379. Efecto del fluido peritoneal sobre la reacción acrosomal
inducida de espermatozoides humanos. MJ Munuce1, 2, A Caille1, C
Berta2 El fluido peritoneal (FP) participa del microambiente donde ocurre la fertilización del ovocito. Nuestro objetivo fue estudiar el efecto del FP sobre la reacción acrosomal inducida (RA). Se utilizó el FP de mujeres estériles sin patología peritoneal, aspirado laparoscópicamente en fecha periovulatoria y los espermatozoides de pacientes normales, libres de anticuerpos. Los mismos fueron seleccionados por Percoll y capacitados en medio Human tubal fluid. Se realizó una incubación de 1 h con FP al 50% v/v, luego de lo cual se indujo la RA tanto con ionóforo (I) de calcio A23187(10µM) como con fluido folicular (FF) al 20% v/v. La RA se visualizó por tinción con Pisum sativum, evaluando 200 células. Los resultados se expresan como media ± SEM y se analizaron por pruebas no paramétricas. El FP disminuyó la RA inducida respecto a los controles sin FP, tanto para el I (18.9±5.1 vs 45.6±5.0 %, p<0.001) como para el FF (7.7±3.0 vs 13.0±4.9%, p<0.05) sin afectar su vitalidad. El FP actuaría modulando la habilidad de sufrir la RA para que esta se gatille en las vecindades del ovocito y no antes.
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