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RESUMENES DE LAS COMUNICACIONES ORALES
INFECTOLOGIA I - VIRUS Coordinadores: C Coto, S Grinstein 65. Infección por Virus de la Hepatitis C (VHC) post-trasplante
renal. Valeria Mas, Susana Albano, Teresita de Alvarellos, D Camps, C
Giraudo, Graciela de Boccardo Con el aumento en la sobrevida del trasplante renal (Tx-r) la enfermedad hepática es una importante causa de morbi-mortalidad en estos pacientes (ptes).Valoramos la evaluación pre-tx y la evolución a largo plazo de VHC post Tx-r. Se estudiaron 61 ptes en el pre-Tx con serología para VHC (ELISA ). Post-Tx, los pacientes VHC(+) fueron testeados con RT-nested PCR (9-18 meses). En las muestras positivas se determinó carga viral (CV). Los pacientes Tx-r con VHC(-) fueron considerados grupo control negativo. Se valoraron transaminasas (ts) y biopsia hepática (bx-h) en ptes con elevación de las mismas. Se analizó nº de rechazos, sobrevida de ptes e injertos, nº de infecciones post-tx. En 29/65 ptes (47,5%) se halló VHC. De los factores de riesgo analizados en el pre-tx, el n°de tx previos (p=0.01), transfusiones (p=0.016) y el tiempo en diálisis (p=0.02) fueron significativos. Trece/29 (44.8%) tenían ARN-VHC pre-tx y mantuvieron la positividad. Sólo 5 ptes (38.5%) elevaron ts. Las bx-h mostraron hepatitis crónica persistente. En el post-tx, 3 ptes más positivizaron ARN VHC. Ninguno de los restantes elevó ts. Hallamos mayor n° de infecciones en los pacientes VHC(+) (6/29 vs 1/32, p=0.01). No hubo diferencias significativas en la sobrevida de ptes e injertos. Las cargas virales fueron de 315630±241920 CV/ml. Sólo el 17.5% de la población VHC(+) tuvo elevación de ts. Las CV fueron elevadas en ausencia de daño hepático por lo que no serían de utilidad en el monitoreo de enfermedad. La sobrevida de pacientes e injertos post Tx-r, no parece ser afectada por VHC a los 18 meses de seguimiento.
66. Mapeo rápido de HSV-1 y HSV-2 por DNA Methyltrans-ferases
Genotyping (DMG). Ana M. Jar, Silvia Mundo, M. Nelson* y O. López El mapeo de restricción del DNA se basa en el clivaje del DNA en fragmentos mediante enzimas y la separación de los fragmentos resultantes por electroforesis. Esta técnica -RFLP- ha sido usada ampliamente para la detección de patógenos y la caracterización de polimorfismos genéticos. Toda enzima de restricción tiene una metiltransferasa de igual especificidad que puede usarse en su reemplazo para detectar polimorfismos. Como las metiltransferasas modifican el DNA internamente en forma específica sin digestión, la metilación puede ser detectada sin necesidad de electroforesis. Usando (1): amplificación por PCR del DNA con primers biotinilados; (2): metilación con tritio y/o digestión específicas y (3): captura del DNA tritiado sobre bolitas de SPA (Scintillation Proximity Assay) cubiertas con estreptavidina, hemos construído mapas ordenados de un fragmento de 102 pb correspondiente a la DNA Polimerasa de los dos tipos del virus Herpes Simplex. Estos mapas nos permitieron determinar y caracterizar la posición relativa de sitios específicos dentro de la secuencia. Este simple método de mapeo requiere solo 30 min para ser realizado y confirmar la identidad del amplicón. Este método puede ser usado para elaborar mapas ordenados de amplicones de secuencias no conocidas, por ejemplo para estudios epidemiológicos.
67. Diseño y validación analítica de PCR cuantitativa
competitiva para Citomegalovirus Humano(CMV). Valeria Mas, Teresita
Alvarellos, Susana Albano, Constancio Giraudo, Graciela de Boccardo CMV es causante de morbi-mortalidad en pacientes (ptes) trasplantados renales (tx-r). Es difícil discriminar los ptes con infección o enfermedad por CMV. Desarrollamos una PCR cuantitativa competitiva para diagnosticar CMV de manera sensible y precoz, con capacidad de diferenciar los ptes que evolucionan a enfermedad. Analizamos su validez analítica y utilidad clínica. Esta técnica utiliza un competidor interno (CI) que contiene las secuencias de los primers para el cuarto exón del gen inmediato temprano (IEA) del CMV usado en la PCR cualitativa. El competidor es agregado en el momento de la extracción del ADN y en un nº conocido de copias. La detección y cuantificación fue realizada en placa de 96 pocillos usando sondas específicas para el CI y CMV. Para analizar la utilidad clínica del test, estudiamos 350 muestras de 65 ptes tx-r consecutivos. El ADN fue extraído de sangre periférica y estudiado usando PCR cualitativa. Las muestras (+) fueron reanalizadas usando el ensayo cuantitativo. La sensibilidad analítica de la reacción fue de 10 CV de CMV/106 células. La especificidad fue establecida utilizando en la reacción ADN de otros herpes virus. El coeficiente de variación intraensayo fue de 27.3%. El ensayo fue lineal en un rango de concentraciones de 4.5x102-1x106/PBMC. El coeficiente de correlación fue de R2=0.999. Las CV de los ptes con enfermedad y sin enfermedad fueron 1438.0±686.6 vs 219.6±117.2 CV/106 PBMC (p<0.01).El ensayo cuantitativo tiene validez analítica. Las CV pueden ser utilizadas para identificar ptes con y sin enfermedad por CMV.
68. Análisis de la secuencia del virus del sarampión causante
del actual brote epidémico (1997/1998). Alicia S. Mistchenko, PR
Barrero El objetivo de este trabajo fue analizar la secuencia del gen de la hemoaglutinina de los virus de sarampión aislados entre octubre 1997 y julio 1998. A partir de secreciones nasofaríngeas de niños con IgM positiva para sarampión se extrajo ARN total y se amplificó directamente por nested-RT-PCR. El producto se secuenció por incorporación directa de ATP- gP33 con deoxi/dideoxinucleótidos. El análisis se realizó en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes y autorradiografía. Se secuenciaron 48 virus correspondientes a las epidemias del 1991, 1994 y 1997/98. Las secuencias del virus de brote actual presentan una alta homología (diferencias <3.2%) y se agrupan en un mismo cluster. Por el contrario, los virus causantes de la epidemia de 1991 se agruparon en un cluster divergente. El análisis filogenético molecular permitió demostrar el origen autóctono del actual brote epidémico.
69. Diagnóstico inmunoquímico rápido del Virus de la Diarrea
Viral Bovina (VDB) por DMG. M Ostroswki, A Pereda, Silvia Mundo,O
López VDB es un virus que infecta terneros produciendo una enfermedad que puede ser leve o complicarse y llevar a la muerte del animal por Enfermedad de las Mucosas. Un diagnóstico que permita determinar la presencia de portadores en forma rápida y que pueda emplearse a campo se constituiría en una herramienta útil para los planes de control. En este trabajo se combinó el uso de metiltransferasas con endonucleasas seguido de Southern blot y la posterior detección inmunoquímica de DNA metilado en sitios específicos utilizando anticuerpos para 6-metiladenina. Esto añade una nueva dimensión al estudio de los amplicones dado que las secuencias metiladas específicamente son detectadas en fragmentos digeridos por una enzima de restricción con un sitio de reconocimiento diferente. Usamos dos juegos de primers que hibridizan en zonas conservadas del 5’ del genoma de los tipos 1 y 2 del VDB y permiten amplificar fragmentos de aproximadamente 160 pb. Todas las reacciones (RT, PCR, metilación y digestión) fueron llevadas a cabo en el mismo buffer que fue diseñado por nosotros para poder realizar todas éstas en la misma mezcla de reacción. Usando esta tecnología pudimos amplificar y caracterizar varios aislamientos de VDB. Esta metodología permite caracterizar los sueros de animales en el mismo día.
70. Estudio serológico retrospectivo de presuntos pacientes de
fiebre hemorrágica argentina (fha) frente a nuevos arenavirus. MA
Morales, G Calderón, J García, A Ambrosio, J Polop *, D Enría, MS
Sabattini A la coexistencia de los virus Junín (JUN) y Coriomeningitis Linfocitaria (LCM) en la Pampa Argentina, se agregó recientemente el conocimiento de dos nuevos genotipos de Arenavirus, aislados de roedores, denominados Oliveros (OLV) y Pampa (PAM). Con el objeto de conocer si estos nuevos agentes son capaces de enfermar al hombre, se enfrentaron sueros de 625 pacientes provenientes de esa región entre los años 1991 a 1996, de los cuales sólo 249 (39.8%) tenían diagnóstico confirmado para JUN, el agente etiológico de la FHA. En un tamizaje inicial por IFI con el suero del período convaleciente de cada paciente, surgieron 48 positivos para el antígeno PAM. Sin embargo al titular todos los sueros disponibles de estos pacientes frente a PAM, JUN y LCM se detectaron respuestas serológicas dobles y triples que pueden obedecer ya sea a antígenos compartidos o a infecciones secundarias. La diversidad en las respuestas dobles y triples sugiere una variabilidad antigénica y genómica de las cepas virales que infectaron a los pacientes. Respuestas primarias para un único virus se presentaron sólo con JUN. Ningún paciente fue positivo sólo para PAM o presentó respuestas más elevadas para este virus, por lo cual este agente y el OLV, fuertemente relacionado a PAM, no están produciendo enfermedad en su zona de dispersión o lo están haciendo con muy baja incidencia.
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