MEDICINA - Volumen 58 - Nº 5/2, 1998
MEDICINA (Buenos Aires) 1998

       
     

       
     

RESUMENES DE LAS COMUNICACIONES ORALES

 

ENDOCRINOLOGIA II - ENDOCRINOLOGIA MOLECULAR
Coordinadores: R Rey, I Luthy

71. Deficiencia de 21-hidroxilasa:Detección de 7 mutaciones del gen CYP21B. L Dain1-5, N Buzzalino1, A Onetto3, S Belli3, M Stivel3, T Pasqualini4, O Pivetta1, E Charreau2-5, L Alba1
Centro Nacional de Genética Médica (ANLIS)1; Instituto de Biología y Medicina Experimental2; Hospital Durand (Servicio de Endocrinología)3; Hospital Italiano (Servicio de Endocrinología)4; Facultad de Ciencias Exactas y Naturales5, Universidad de Buenos Aires

Presentamos los resultados del estudio de 7 mutaciones: Val281Leu(V281),A/C-G I2(I2),Pro30Leu(P30), Cluster E6(E6), I173 N(I173), Q319 X(Q319) y deleción de 8pb(D8pb) en 70 alelos correspondientes a 35 pacientes:24 no clásicos (NC) y 11 clásicos (C)(8 perdedores de sal (PS) y 3 virilizantes simples (VS),afectados de hiperplasia suprarrenal congénita por déficit de 21 hidroxilasa.Se estudiaron además 66 alelos de 33 familiares y 34 de 17 controles.Las mutaciones se detectaron por PCR alelo específica excepto P30 que se estudió por SSCP.Las frecuencias alélicas halladas fueron: NC:V281: 0.19; I2: 0.12; E6: 0.02; I173: 0.02; Q319: 0.08; P30: 0 y D8pb: 0. C: V281: 0.05; I2: 0.17; E6: 0.04; I173: 0.09; Q319: 0;P30: 0.06 y D8pb: 0.25. Los alelos estudiados en los familaires excluyen mutaciones de novo. Se detectó un portador entre los controles. Los resultados obtenidos sugieren una frecuencia alélica disminuída para V281 y P30. Contrariamente a lo hallado en poblaciones de origen latino,la mutación E6 aparece como causa de la enfermedad en la muestra analizada.’

72. Mutaciones del gen cyp21b en pacientes con formas clásica (fc) y no clásica (fnc) de hiperplasia suprarrenal congénita (HSC). Andrea Dardis, B. Geraghty, I. Bergadá, M Gryngarten, ME Escobar, H Domené, T Pasqualini, C. Bergadá, MA Rivarola, A Belgorosky
Servicios de Endocrinología Hospitales Garrahan y Niños R. Gutiérrez; Pediatría, Hospital Italiano, Buenos Aires

En pacientes con HSC por déficit de 21 hidroxilasa el 25% de las alteraciones del gen CYP21B son deleciones o macroconver-siones génicas y el 75% mutaciones puntuales (MP). En 69 pacientes (138 alelos), FC : n=52 ( 38 perdedora de sal y 14 virilizante simple) y FNC: n=17. Se evaluaron las siguientes alteraciones moleculares del gen CYP21B: Deleciones y macroconver-siones génicas, por Southern blot, las MP In2, I172N, Ex 3, R356W, Cluster Ex6, P30L y V281L, por PCR más ASO y Q318X por PCR más digestión con Pst1. Las alteraciones más frecuentes presentes en las FC fueron: Deleciones o macroconversiones (21.1%) e In2 (24%). La MP Q318X presentó una frecuencia elevada comparada con la reportada para población norteamericana (11.5% vs 4.8%), siendo similar a la reportada en población española. El genotipo completo pudo ser establecido en un 73% de los pacientes con la FC y el porcentaje de alelos caracteri-zados fue del 83.7%. En la FNC la MP más frecuente fue la V281L (50%). El genotipo completo pudo ser establecido en un 58.8%, siendo el porcentaje total de alelos discriminados del 79.2%. Un 29.2% de estos pacientes presentaron en uno de sus dos alelos una alteración asociada a la FC. Las dificultades diagnósticas de algunos pacientes con FNC y el hecho de que los pacientes con FNC puedan ser portadores de una alteración molecular de la FC plantea la rele-vancia de realizar diagnóstico molecular en este grupo de pacientes.

 

73. Cinética y regulación hormonal de la expresón del gen CYP19 (Cp450arom) en células testiculares humanas (Cth) en cultivo. Nora Saraco, E Berensztein, A Dardis, MA Rivarola y A Belgorosky
Laboratorio de Investigación, Hospital de Pediatría J.P. Garrahan, Buenos Aires

Hemos reportado previamente al 6to dia de cultivo de cTh inmaduras (I), falta de detección del RNAm de cP450arom por RT-PCR revelada con Bromuro de Etidio. Además, la secreción basal de testosterona se incrementaba en las células I pero no en las maduras durante los días de cultivo. El objetivo de este estudio fue evaluar con una técnica molecular más sensible (RT-PCR semicuantitativa con 32P) la cinética de expresión del gen CYP19 en 2 cultivos de cThI con una edad cronológica (EC) de 0.33 y 3 años (a) los días 2, 4 y 6 de cultivo, y la regulación de la expresión del gen CYP19 bajo rhFSH (2 ng/ml), hLH (10 ng/ml) y rhIGF-1 (50 ng/ml) al 6to día en 3 cultivos de cThI (EC : 0.08, 0.11, 1 a) y en 1 puberal (P) (EC : 15a). Durante los días de cultivo se observó una disminución del RNAm de cP450arom (0.33a: (X±ES) 1.85 ± 0.03, 0.45 ± 0.19, 0.99 ± 0.01 y 3a : 0.44 ± 0.05, 0.07 ± 0.01 y 0.07 ± 0.07 UA, día 2, 4 y 6 de cultivo respectivamente, p<0.05). En los cultivos de cThI el RNAm de cP450arom disminuyó con : rhFSH en 3 de 3, hLH en 2 de 3 y hrIGF-1 en 2 de 2, p<0.05, mientras que no se observaron cambios significativos en el cultivo de cThP. Los resultados obtenidos sugieren que la disminución de la expresión del gen CYP19 durante los días de cultivo en los cThI se asocia con el incremento de la secreción basal de testosterona descripto previamente. Por otro lado la rhFSH, hLH y el hrIGF-1 modulan en forma negativa la expresión del gen CYP19.

 

74. Expresión de la enzima aromatasa citocromo p450 (cp450arom) y de los receptores de estrógenos a y b (re-a y b) en craneofaringeomas (cras). Sebastian Oknaian, N Saraco, A Dardis, D Díaz, F Lubieniecki, A L Taratuto, G Zuccaro, MA Rivarola, A Belgorosky
Laboratorio de Investigación y Servicio de Patología, Hospital Garrahan, Buenos Aires

Los CRAs son histológicamente neoplasias epiteliales benignas de la región selar. Ha sido descripto una mayor incidencia durante la pubertad y se ha sugerido que los esteroides sexuales podrían afectar el crecimiento de los CRAs. Recientemente se ha descripto la expresión del gen del RE-a en las células epiteliales de los CRAs, sin embargo no existe informa-ción disponible sobre la expresión del gen del RE-b. Debido a que los androgenos pueden actuar en el SNC por conversión local a estrogenos, el objetivo de este estudio fue evaluar la expresión del RNAm de la cP450AROM y dilucidar que tipo de RE se expresa en los CRAs. La expresión del RNAm de la cP450AROM fue evaluada por RT-PCR en 11 CRAs (5 mujeres y 6 varones con una edad cronológica media de 9.36 ± 4.13 años) en presencia de primers marcados con 32P. La expresión de los RNAm de los REs fue evaluada por RT-PCR en 10/11 CRAs con primers específicos, visualizados en gel de agarosa al 2 %, teñidos con BrEt. La amplificación de los fragmentos de 293, 273 y 260 pb corres-pondientes al cDNA de la cP450AROM, RE-a y RE-b respectivamente fue observada en todos los casos estudiados.La especificidad de los productos amplificados fue confirmada por digestión con las enzimas de restricción Hinf I y Rsa I (cP450AROM),Cfo I (RE-a) e Hinf I (RE-b).Estos resultados sugieren que la cP450AROM podría estar presente en las células de los CRAs y que podrían coexistir los dos tipos de ERs en estos tejidos, avalando la posibilidad de que las hormonas sexuales modulen el crecimiento tumoral y de que hubiera respuesta a manipulaciones hormonales terapéuticas.

 

75. Impacto funcional de la transferencia génica mediada por vectores herpéticos en células adenohipofisarias. Federico Bolognani1, CG Albariño2, V Romanowski2, PR Lowens-tein3, MG Castro3, RG Goya1
1INIBIOLP-Histología B, Facultad Ciencias Médicas, 2IBBM, Facultad Ciencias Exactas, UNLP; 3Molecular Medical Unit, University of Manchester, Inglaterra

En estudios previos demostramos que los vectores herpéticos HSV1 derivados del mutante termosensible tsK resultan efectivos para transferir genes en cultivos de células adenohipofisarias (AP) normales y tumorales. En el presente estudio se determinó el efecto de la infección aguda con el vector tsK/ß-gal sobre la secreción hormonal de células provenientes de hipófisis normal de rata o de tumores hipofisarios. Luego de 16 h de infección, se midieron los niveles de secreción de prolactina (PRL) y hormona de crecimiento (GH). Se demostró por inmunofluorescencia que el virus infecta efectivamente las células prolactotropas y somatotropas, expresando el transgen indicador. En células AP normales, multiplicidades de infección de 1, 2 y 5, redujeron en un 28-29% la liberación de PRL y en un 45-50% la de GH. La inhibición correspondiente a células AP de tumores hipofisarios fue de 21-54% para PRL y 46-64% para GH. Se concluye que la transferencia génica en células AP reduce la liberación de PRL y GH, especialmente en las células tumorales.

76. Interleuquina-1 aumenta la sensibilidad a los glucocorticoides en una línea corticotrofa de ratón (AtT20): efectos sobre la expresión de POMC y liberación de ACTH. Damián Kovalovsky, Mónica Costas, Eduardo Arzt.
Laboratorio de Fisiología y Biología Molecular, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires

Así como se ha demostrado la importancia de los glucocor-ticoides como reguladores y controladores de la respuesta inmune, el eje hipotálamo-pituitario-adrenal (HPA) es regulado recíprocamente por citoquinas. En este trabajo nos centramos en los efectos modulatorios que ejerce IL-1 (interleuquina-1) en la hipófisis. Utilizamos una línea celular corticotrófica de ratón (AtT20), y medimos la actividad transcripcional del gen de proopiomelanocortina (POMC) mediante transfecciones con un gen reporter, cloranfenicol acetil transferasa (CAT) bajo el control de este promotor; realizamos ensayos de northern-blot; y analizamos mediante RIA la hormona ACTH liberada al medio de cultivo. Observamos que tanto en los experimentos de transfección, como en los de secreción, un pretratamiento por 20hs con IL-1 (1-100 U/ml) produce un aumento en la inhibición producida por un tratamiento posterior con glucocorticoides (1-100 nM) bajo estimulación por CRH (20-100 nM), (ej: Dex 10 nM no inhibe (0 %) a CRH 20 nM, y por priming produce un 35 % de inhibición). Sin embargo estos cambios no se ven cuando se analiza el mRNA de POMC, cuya variación se observa solo bajo tiempos más largos de estimulación. Concluimos que IL-1 además de sus efectos directos sobre el eje HPA, ejerce un efecto modulador aumentando la sensibilidad de la línea tumoral hipofisaria AtT20 a los glucocorticoides a nivel de la transcripción de POMC y la liberación de ACTH, sugiriendo que fenómenos similares podrían ocurrir en la hipófisis normal.