LA MIELOPEROXIDASA COMO FACTOR DE DAÑO OXIDATIVO DEL MIOCARDIO: INACTIVACION DE LA DIHIDROLIPOAMIDA DESHIDROGENASA

JOSE GUTIERREZ CORREA, ANDRES O. M. STOPPANI

Centro de Investigaciones Bioenergéticas, Facultad de Medicina (UBA-CONICET), Universidad de Buenos Aires

Key words: lipoamide dehydrogenase, myeloperoxidase, hypochlorite, thiols, chloropromazine, paracetamol

Resumen

La dihidrolipoamida deshidrogenasa de miocardio (LADH) es inactivada por incubación a 30°C con sistemas pro-oxidantes dependientes de la mieloperoxidasa (MPO) de leucocitos. La inactivación varía según la composición del sistema pro-oxidante y del tiempo de incubación con la LADH. Con el sistema MPO/H2O2/ClNa las inactivaciones obtenidas fueron 64 y 87% a 30 y 60 min de incubación, respectivamente. En ausencia de ClNa, la inactivación fue de 9 y 27% mientras que en ausencia de MPO fue de 4.0 y 11%, respectivamente. El ClONa, producto de la peroxidación del ión Cl- por el sistema MPO/H2O2, inactivó la LADH 72-81% según el tiempo de incubación con la enzima, confirmando la función del ácido hipocloroso como agente del sistema MPO/H2O2/ClNa. Los sistemas MPO/H2O2/IK, MPO/H2O2/SCNK y MPO/H2O2/NO2Na también inactivaron la LADH, en grado dependiente de la naturaleza del anión. El anión ioduro fue el mas activo. El sistema MPO/NADH/IK, donde el NADH reemplazó al H2O2, inactivó la LADH. La catalasa previno esa inactivación, de acuerdo con la función del NADH como generador de H2O2. La MPO catalizó la inactivación de la LADH por los sistemas H2O2/Cloropromazina y H2O2/Paracetamol. Compuestos tiol (Captopril, penicilamina, GSH, cisteína, N-acetilcisteína y mercaptopropio-nilglicina), la taurina y el ascorbato protegieron a la LADH frente a los sistemas dependientes de MPO; y frente al ClONa. Los resultados reseñados se discuten en relación a la función de la MPO como catalizador de la producción de oxidantes capaces de contribuir al daño del miocardio por isquemia-reperfusión, como consecuencia de la patología de la inflamación, o por acción de fármacos.

Abstract

Inactivation of heart dihydrolipoamide dehydrogenase by leukocyte myeloperoxidase-dependent systems. Prevention by Captopril and other thiol compounds. Myocardial dihydrolipoamide dehydrogenase (LADH) is inactivated after incubation at 30°C, with myeloperoxidase (MPO)-dependent systems. The enzyme inactivation was a function of the pro-oxidant system composition and the time of incubation. The standard inactivating system contained 50 mM KH2PO4-K2HPO4, pH 7.4, 0.5-1.0 µM LADH, and pro-oxidant system. After 30 or 60 min of incubation with the MPO/H2O2/NaCl system, LADH inactivation was 64 and 87%, respectively (Figure 1). In the absence of NaCl, inactivation values were 9 and 27%, respectively, whereas in the absence of MPO the inactivation values were 4.0 and 11%, respectively (Figure 1). Under similar experimental conditions, sodium hypochlorite significantly inactivated LADH, thus supporting the role of hipochlorous acid as agent of the MPO/H2O2/ClNa system. With the MPO/H2O2/KI, MPO/H2O2/KSCN or the MPO/H2O2/NaNO2 systems LADH inactivation depended on the anion nature, I- being the most effective (Figure 2). NaNO2 effectively replaced halides as pro-oxidant (Figure 3). The MPO/NADH/halide systems, where NADH replaced H2O2, also inactivated LADH. Native (not denatured) catalase completely prevented the MPO/NADH/KI system effect (Table 1), in close agreement with H2O2 production by the LADH-catalysed NADH oxidation and the role of H2O2 in LADH inactivation. LADH was also inactivated after incubation with MPO-generated free radicals such as the Chloropromazine and Paracetamol radicals (Table 2). Thiol compounds (Captopril, penicillamine, cysteine, N-acetylcysteine and mercaptopropionylglycine) (Table 3 and Figure 4), as well as taurine, ascorbate (Table 4), GSSG and trypanothione (Figure 5), protected LADH against the MPO-dependent oxidizing systems, and also against NaClO (Table 4). The summarized observations are discussed in relation to MPO function in free radical production and pathologies such as ischemia-reperfusion injury and inflammation.

Dirección postal: Dr. Andrés O.M. Stoppani, Centro de Investigaciones Bioenergéticas, Facultad de Medicina (UBA-CONICET), Paraguay 2155, 1121 Buenos Aires, Argentina
Fax: (541) 961-6521. E-mail: stoppani@mail.retina.ar

Recibido: 19-I-1998 Aceptado: 18-III-1998

Es sabido que los leucocitos polimorfonucleares neutrófilos y los macrófagos contribuyen a las lesiones del miocardio y de otros tejidos, resultantes de la reperfusión post-isquemia y la inflamación1-4. Esas acciones se deben principalmente a la producción, por esas células, de a) el ácido hipocloroso (ClOH/ClO-)5-8; b) el radical anión superóxido (O2-)9-15 y c) el óxido nítrico (ON) y sus derivados activos16-20.
La mieloperoxidasa (MPO) de los leucocitos tiene una función esencial en la producción de especies oxidantes citotóxicas, que causan, entre otros efectos, la acción bactericida6, 7, 21. La MPO utiliza H2O2 y ión cloruro (Cl-) para la producción de ácido hipocloroso (ClOH); (Reacción 1) donde el H2O2 es generado en los mismos leucocitos, por la NADPH-oxidasa.

H2O2 + Cl- + H+ - - - - -> ClOH + H2O (1)

La Reacción 1 involucra la producción de un intermediario redox, el «Compuesto I», un catión radical ferrilo, único compuesto de la MPO capaz de oxidar Cl- y demás haluros. De esa manera, el ácido hipocloroso es el único oxidante fuerte producido por los neutrófilos21. La MPO tiene además otras actividades catalíticas21. En efecto (a) reacciona con el anión superóxido (O2-)21 generando la oxo-mieloperoxidasa que, en presencia de H2O2 forma el «Compuesto II»; (b) compleja al ON19-21 y cataliza la producción de radical NO2., utilizando el ión nitrito como sustrato; (c) peroxida a diferentes moléculas orgánicas oxidables, formando los radicales libres correspondientes (catiónicos o aniónicos)22-24; (d) hidroxila moléculas aromáticas10. Una descripción actualizada de esas reacciones se encuentra en la Referencia 21.
La lipoamida deshidrogenasa (LADH) es una enzima mitocondrial de fundamental importancia para la generación de energía en el músculo cardíaco. Es inhibida por los radicales libres del oxígeno25-29, por lo que constituye un blanco óptimo para las especies activas generadas por la MPO. Los resultados reseñados en este trabajo muestran que, efectivamente, esas especies inactivan a la LADH y de esa manera podrían contribuir al daño tisular producido por otros oxi-radicales (sistemas Fenton), como consecuencia de la reperfusión post-isquemia o de la inflamación. Compuestos tioles, algunos de uso terapéutico, como el Captopril (CPT) contrarrestan la acción pro-oxidante de los sistemas dependientes de la MPO.

Material y métodos

La LADH y la MPO se obtuvieron de Sigma Chemical Co, Saint Louis, MO, USA. La LADH de corazón de porcino, tenía actividad específica de 100-130 U/mg de proteína. La suspensión original, se diluyó con solución de KH2PO4-K2HPO4 50 mM, pH 7.4 y se conservó a 4°C. En esas condiciones la actividad de la enzima se mantuvo no menos de un mes. La MPO de leucocitos humanos, tenía actividad específica de 50-100 U/mg de proteína, según las muestras. Esa actividad se determinó según Referencia 30, con guayacol 13 mM y H2O2 0.33 mM como sustratos, midiéndose el producto de la reacción a 470 nm. El ClONa (7% p/v) se obtuvo de Carlo Erba, Milán, y su concentración se midió a 292 nm (e = 350 M-1 • cm-1). El H2O2 se obtuvo de Merck and Co, Darmstadt, Alemania y la concentración se midió a 240 nm (e = 40 M-1 • cm-1). El ClNa, IK y NO2Na se obtuvieron de J.T. Baker, Phillipsburg, NJ, USA. El CPT, la N-acetilcisteína (NAC), la penicilamina (PAM), la mercaptopropionilglicina (MPG), la Cloropromazina y el Paracetamol se obtuvieron de Sigma Chemical Co, St. Louis, MO, USA. Otros reactivos fueron los mismos utilizados anteriormente25-29.

Actividad enzimática

La actividad lipoamida reductasa de la LADH se midió por la velocidad de oxidación del NADH, por espectrofotometría a 340 nm. La mezcla de reacción contenía PO4H2K-PO4HK2 50 mM, pH 7.4, una alícuota de la mezcla de inactivación de la LADH, lipoamida 1.0 mM y NADH 0.2 mM. Otras condiciones fueron iguales a las utilizadas anteriormente25-29.

Inactivación de la LADH

La enzima (1.0 µM) se incubó a 30°C, en 200 µl de PO4H2K-PO4HK2 50 mM, pH 7.4, con MPO, H2O2 y otras adiciones, como se indica en Resultados. Finalizada la incubación, se tomó una alícuota, se añadió a la mezcla de reacción en la celda del espectrofotómetro, y se midió la actividad lipoamida reductasa. Otras condiciones fueron iguales a las utilizadas anteriormente25-29.

Expresión de los resultados

Se procedió como en trabajos anteriores25-29. La inactivación de la LADH por el sistema MPO se representa por su valor porcentual (I (%)) calculado por la Ecuación 1, donde AT y AMPO son las actividades de la enzima testigo y de la enzima inactivada por el sistema MPO, respectivamente. La protección P de la LADH contra los diferentes sistemas inactivantes se representa por el valor porcentual correspondiente P (%)) que se calculó con la Ecuación 2, donde IMPO y IMPO-p son la

I (%) = 100 (AT - AMPO)/AT (%) (1)

P (%) = 100 (IMPO - IMPOip)/IMPO (%) (2)

inactivación de la LADH por el sistema MPO y la inactivación de la LADH por el sistema MPO más el protector P, respectivamente. Todas las determinaciones se hicieron en muestras duplicadas y los valores presentados son el promedio correspondiente. La diferencia entre el valor promedio y los valores experimentales fueron menos del 6%. En cada condición experimental, las actividades enzimáticas que resultaron de la inactivación de la LADH se compararon con la actividad de la enzima pura, valor que se tomó como testigo. Esta última actividad se mantuvo constante, lo que excluyó la probabilidad de variancia proveniente de la LADH. Por consiguiente, las variaciones observadas fueron imputables solamente al error experimental, inherente a cada determinación de la actividad enzimática, en todos los casos menor de 6%.

Resultados

Inactivación de la LADH por sistemas MPO

La Figura 1 muestra el efecto del sistema MPO/H2O2/ClNa sobre la activiad de la LADH. Se puede ver que (a) la incubación de la enzima con el sistema completo produjo inactivación significativa que alcanzó valor máximo después de 60 min de incubación; (b) el efecto fue mayor con H2O2 100 mM, comparado con el obtenido con H2O2 50 mM; (c) la omisión de MPO o del ClNa suprimió o disminuyó significativamente la inactivación de la LADH. La incubación de la enzima con ClNa solamente, o con MPO y ClNa no modificó la actividad (efectos omitidos). Estos resultados concuerdan con la formación del ácido hipocloroso (ClOH) como intermediario del sistema MPO/H2O2/ClNa, para la inactivación de la LADH. En efecto, el hipoclorito de sodio 50 µM, produjo 50 y 63% de inactivación de la LADH, a 30 y 60 minutos de incubación respectivamente, mientras que el hipoclorito de sodio 100 µM produjo 76 y 83% de inactivación a 30 y 60 minutos respectivamente. Estas observaciones confirman la hipótesis propuesta.
Se considera al ión Cl- como sustrato fisiológico de la LADH, debido a su concentración relativamente alta en el plasma sanguíneo (100-140mM), en contraste con el l- (< 1.0 µM), el Br’- (20-100 µM) y el tiocianato (20-120 µM) (Referencia 31). Por la Reacción 1, la MPO oxida a esos iones formando los ácidos hipocloroso, hipoiodoso, hipobromoso e hipotiocianoso, respectivamente. La Figura 2 muestra la inactivación de la LADH por los sistemas MPO/H2O2/IK y MPO/H2O2/SCNK, efectos que la misma figura permite comparar con la inactivación de la LADH por el sistema MPO/H2O2/ClNa. El ión I-, a pesar de su concentración mil veces menor que la del Cl-, resultó un potente activador del sistema pro-oxidante y lo mismo ocurrió con el ión SCN-. El efecto del ión Br’- 1.0 mM, (omitido), fue en valores absolutos igual al del ión Cl-. La Figura 3 muestra que el ión haluro pudo ser reemplazado por el ión nitrito, cuyo efecto fue proporcional a su concentración. En ausencia de MPO ninguno de los aniones ensayados produjo inactivación significativa de la LADH (resultados omitidos). Sin embargo, a pH 7.4 el sistema MPO/H2O2/NO2Na (0.5 U/ml; 0.1 mM; 0.5 mM), inactivó sólo el 35 y 51% de la LADH, a 1 y 2 horas de incubación respectivamente (resultados omitidos).
La sustitución del H2O2 por NADH en el sistema pro-oxidante no modificó sustancialmente la inactivación de la LADH. La Tabla 1 ilustra experimentos típicos con sistemas MPO/NADH/haluro. Los resultados presentados concuerdan con los descriptos en la Figura 2, especialmente en relación con la menor actividad del anión Cl- frente a los otros iones. El ión Br’- tuvo actividad dos veces mayor que la del ión SCN-. La adición de catalasa (nativa) produjo la inhibición completa del sistema MPO/NADH/IK lo que prueba la utilización por la MPO, del H2O2 producido por la oxidación del NADH, reacción catalizada por la LADH. El efecto del NADH es importante porque en el miocardio isquemiado la concentración de NADH es anormalmente elevada.
El sistema MPO/H2O2 es capaz de capturar un electrón de moléculas orgánicas, generando el radical libre correspondiente. Así ocurre con las drogas Cloropro-mazina y Paracetamol, una fenotiazina y un fenol, respectivamente. Esos radicales inactivan a la LADH (Tabla 2).

Protección de LADH por tioles

La Figura 4 muestra que los tioles CPT, GSH y NAC previenen la inactivación de la LADH por el sistema MPO/H2O2/ClNa. La protección fue proporcional a la concentración de tiol en el rango de 50-100 µM. El efecto protector de la MPG y la PAM (150 µM) también se demostró frente al sistema MPO/H2O2/IK. La protección fue completa durante los primeros 10 minutos de incubación, pero con MPG este efecto disminuyó significativamente durante los 10 últimos minutos, de 20 a 30 minutos (resultados omitidos).
Los resultados en la Tabla 3 indican que los compuestos tiol protegieron a la LADH contra el sistema MPO/H2O2/ClNa y contra el hipoclorito, de acuerdo a un modelo común caracterizado por: (a) una protección efectiva (superior al 80%) por tioles a la concentración 100 µM (excepto NAC con hipoclorito) y (b) una protección menor de 80% con todos los tioles, a la concentración 50 µM, excepto PAM con hipoclorito, con el que la protección fue de 84%. Protecciones significativas se obtuvieron con taurina, un antagonista selectivo del hipoclorito y con ascorbato (Tabla 4). Los disulfuros también protegieron a la LADH frente al sistema MPO/H2O2/ClNa. La Figura 5 muestra los resultados con GSSG y TS2. La comparación de esos efectos con los de los tioles libres (Tabla 3) revela la menor actividad de los disulfuros.

Discusión

Los resultados presentados en las Figuras 1 y 2 y en la Tabla 1 muestran que el ácido hipocloroso, generado por los sistemas MPO/H2O2/ClNa y MPO/NADH/ClNa, es el agente principal de la inactivación de la LADH por esos sistemas. En efecto, la omisión de cualquiera de sus componentes previno o disminuyó significativamente la inactivación de la LADH. Con los sistemas MPO/H2O2/Cloropromazina y MPO/H2O2/Paracetamol, el agente inhibidor fue el radical libre de la molécula orgánica22-24, producido por su peroxidación con el sistema MPO/H2O2 (Tabla 2). Este mecanismo de inactivación de la LADH, tendría importancia farmacológica sólo en aquellas oportunidades en que por razones terapéuticas el fármaco es accesible a la LADH.
El sistema MPO/H2O2 oxida a haluros (Cl-, Br’-, I-) y seudo haluros (SCN-) para formar los hipoácidos correspondientes21, 31, 32 de los cuales, el ácido hipocloroso pudo ser usado en este estudio por su fácil obtención como hipoclorito de sodio. En general, la actividad química o biológica de los sistemas MPO/H2O2/haluro se puede relacionar con la velocidad de oxidación del haluro, que es máxima para el ioduro y mínima para el cloruro21, 31. La actividad pro-oxidante (halogenante) del sistema MPO/H2O2/IK es superior (Figura 2) a la del sistema MPO/H2O2/ClNa, a pesar de la mayor concentración del ClNa respecto al IK. Sin embargo las bajas concentraciones del I-, Br’- y SCN- en los medios orgánicos31, hacen que el sistema MPO/H2O2/ClNa sea el más importante como sistema pro-oxidante leucocitario.
Los resultados en la Figura 3 muestran que el ión nitrito, en las condiciones especificadas, puede reemplazar a los haluros como agente del sistema MPO/H2O2 y efectos similares se pueden obtener respecto a la acción bactericida de los sistemas dependientes de MPO19. El efecto del ión nitrito es importante dada la producción tisular del ON, precursor inmediato del ión nitrito. Por este motivo, el ión puede contribuir, in vivo, a la citotoxicidad del sistema MPO/H2O2. La acción pro-oxidante del NO2Na, (Figura 3) se explica por la formación del radical NO2•, como consecuencia de la interacción del ión nitrito (NO2-) con el «Compuesto I» y el «Compuesto II» de la MPO18-20. El radical NO2• es capaz de varias reacciones importantes, entre otras, la nitración de la tirosina, que sería un aminoácido esencial para la actividad de la LADH.
La mayoría de los tioles ensayados impidió la inactivación de la LADH por el sistema MPO/H2O2/ClNa y también por el hipoclorito (Tabla 3 y Figura 4). Lo mismo ocurrió con el sistema MPO/H2O2/IK (resultados omitidos). Entre los tioles estudiados se encuentran el glutatión reducido (GSH), el CPT, NAC, MPG y PAM, todos ellos utilizados en medicina humana con diferentes fines terapéuticos. La acción protectora frente al ácido hipocloroso puede constituir un efecto compatible con los específicos de cada uno de los tioles utilizados, especialmente en relación con una acción antinflamatoria33, 34. La descomposición del ácido hipocloroso por los tioles constituiría entonces una contribución significativa a la farmacología de los tioles. La acción antioxidante, en particular la del GSH, se produciría según las Reacciones 2-4 (Referencias 35-39). En la primera etapa (Reacción 2)

GSH + ClOH - - - -> GSCl + H2O (2)

interviene una molécula de ClOH. En la segunda, el derivado clorado GSCl reacciona con (a) dos moléculas de ácido hipocloroso y forma el cloruro de sulfonilo (GSO2Cl; Reacción 3) o (b) una molécula de GSH y forma el glutatión oxidado (GSSG; Reacción 4).

GSCl + 2ClOH - - - - > GSO2Cl + 2Cl- + 2H+ (3)

GSCl + GSH - - - -> GSSG + Cl- + H+ (4)

El cloruro de sulfonilo puede formar una sulfonamida u otros compuestos no tóxicos20 de estructura indeterminada. La estequiometría de la reacción GSH-ClOH muestra que una molécula de GSH puede descomponer tres moléculas de ClOH (Reacciones 2 y 3). Una cuarta molécula se descompone por una reacción con un grupo amino del GSH, formando la cloramina20. La presencia de un grupo NH3+ vecino al tiol es importante para la reactividad de este último.
Los disulfuros, como el glutatión oxidado (GSSG) y la TS2 también descomponen al ácido hipocloroso37, pero son menos eficaces que el correspondiente tiol, lo que explica la menor acción protectora del GSSG y la TS2 en la Figura 5. En la célula, el GSSG es un producto específico de la desintoxicación del ácido hipocloroso38. El efecto protector de la taurina (Tabla 4) depende exclusivamente de su grupo amino, que forma con el ClOH la cloramina correspondiente, por un mecanismo que puede ser no-enzimático, lento o dependiente de MPO39. El ácido ascórbico constituye otro protector de la LADH frente al sistema MPO/H2O2/ClNa y al hipoclorito (Tabla 4).
Su acción se debe a la oxidación del ácido ascórbico a dehidroascórbico, oxidación dependiente de la descomposición del ácido hipocloroso35.
El ácido hipocloroso inactiva enzimas de diferentes orígenes y propiedades40-45 entre ellas, enzimas antioxidantes, como la superóxido dismutasa, la catalasa y la glutatión peroxidasa40-42. El ácido hipocloroso y el sistema MPO/H2O2/ClNa también modifican proteínas como la albúmina sérica46, la fibronectina47, la LDL48, 49, proteínas tisulares (aorta)50 y HDL51. Las modificaciones de la LDL, la HDL y las proteínas de la aorta son importantes para la fisiopatología de la aterosclerosis. En todos esos casos se modifican la tirosina, por cloración u oxidación a un radical, que forma bi-tirosina. Los mismos sistemas oxidan a la tirosina libre o en péptidos, como Gli-Gli-Tyr-Arg51-55, lo que refuerza la convicción de que la modificación de la tirosina es un factor importante de la inactivación de la LADH. Sin embargo, en otras proteínas, el triptofano, la serina y la cisteína son también atacados56 lo que significa que la inactivación de la LADH puede implicar la posibilidad de varias alteraciones de la estructura proteica, lo que justifica su investigación.

Agradecimientos: este trabajo se realizó con subsidios de la Universidad de Buenos Aires y la Fundación Alberto J. Roemmers. CEDIQUIFA contribuyó con una beca de investigador formado al Dr. José Gutiérrez Correa. MG Gutiérrez y MAE Verón prestaron eficaz ayuda técnica.

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TABLA 1.- Inactivación (%) de la LADH por sistemas MPO/NADH/Haluro

Haluro Tiempo de Incubación (min)
10 20 30 45

Cloruro 9 24 30 48
Tiocianato 23 36 40 50
Bromuro 39 79 89 91
Ioduro 89 90 95 96
Ioduro + CAT N 4 4 4 4
Ioduro + CAT D 93 95 96 96

El medio de la reacción contenía PO4H2K-PO4HK2 50 mM, pH 7.4; LADH 1.0 µM; NADH 0.1 mM, MPO 0.5 U/ml y haluro: ClNa 150 mM, BrNa 1.0 mM, IK 0.1 mM; SCNK 1.0 mM CAT N (catalasa nativa): 5 µg/ml (120 U/ml), CAT D (catalasa desnaturalizada térmicamente)): 5 µg/ml. Otras condiciones experimentales se describen en Material y métodos. Los valores representan la inactivación (%) de la LADH. La inactivación de la LADH por el sistema NADH/IK (0.1 mM; 0.1 mm), en ausencia de MPO fue: 9, 12, 14 y 16% a 10, 20, 30, 45 min de incubación, respectivamente. Los sistemas MPO/IK y NADH/Br Na o NADH/SCNK modificaron en grado no significativo (< 5%) la actividad de la LADH.

TABLA 2.- Inactivación (%) de la LADH por los sistemas MPO/H2O2/Cloropromazina y MPO/H2O2/Paracetamol

Sistema Tiempo de
Incubación (min)
10 30

MPO/H2O2/Cloropromazina 35 49
MPO/H2O2/Paracetamol 26 47

La mezcla de inactivación contenía PO4H2K-PO4HK2 50 mM, pH 7.4, LADH 1.0 µM y sis-tema MPO/H2O2/Cloropromazina (0.5 U/ml; 0.2 mM; 0.1 mM) o MPO/H2O2/Paracetamol (0.5 U/ml; 0.25 mM; 0.5 mM) como se indica. Otras condiciones experimentales según Material y métodos. En ausencia de MPO, la inactivación de la LADH fue 5% en ambos casos.

TABLA 3.- Protección (P%) de la LADH por tioles frente al sistema MPO/H2O2/ClNa y al ClONa

Tiol Concentración Pro-oxidante Pro-oxidante
(µM) MPO/H2O2/ClNa ClONa

CPT 50 70 -
100 97 100
GSH 50 42 69
100 92 95
Cys 50 - 37
100 84 89
NAC 50 36 27
100 90 75
PAM 50 - 84
100 106 98
MPG 50 - 37
100 100 99

La mezcla de inactivación contenía el sistema MPO/H2O2/ClNa (0.5 U/ml; 0.1 mM; 100 mM) o ClONa 0.1 mM; tioles como se indica en la Tabla. Tiempo de incubación, 30 min. Otras condiciones experimentales según Material y métodos. La inactivación de la LADH en ausencia de tioles fue de 61% con MPO/H2O2/ClNa y 81% con ClONa.

TABLA 4.- Protección (%) de la LADH por taurina y ascorbato, contra el sistema MPO/H2O2/ClNa y el hipoclorito de sodio

Protector Pro-oxidante Tiempo de
(mM) incubación (min)
30 60

Taurina (1.0) MPO/H2O2/ClNa 48 39
ClONa 35 44
Taurina (5.0) ClONa 73 62
Ascorbato (0.10) MPO/H2O2/ClNa 59 71
ClONa 37 42

La mezcla de inactivación contenía el sistema MPO/H2O2/ClNa, ClONa, taurina y ascorbato como se indica. Otras condiciones experimentales según la leyenda de la Tabla 3. Inactivación de la LADH por el sistema MPO/H2O2/ClNa, 58 y 81%, a 30 y 60 min de incubación; por el ClONa, 76 y 83%, a los mismos tiempos

Fig. 1.- Inactivación de la LADH por el sistema MPO/H2O2/ClNa. La mezcla de inactivación contenía PO4H2K-PO4HK2 50 mM, pH 7.4, LADH 1.0 µM; MPO (0.5 U/ml, H2O2 100 (o 50) µM y ClNa 100 mM (Cl-), como se indica en la Figura. El tiempo de incubación se indica en la abscisa. Otras condiciones experimentales según Material y métodos.

Fig. 2.- Inactivación de la LADH por los sistemas MPO/H2O2/IK y MPO/H2O2/SCNK. La mezcla de inactivación contenía MPO/H2O2/IK o SCNK, o ClNa (I- 0.1 mM; SCN- 0.5 mM; Cl- 100 mM), como se indica. Otras condiciones experimentales según la leyenda de la Figura 1 y Material y métodos. C, testigo sin MPO.
Fig. 3.- Inactivación de la LADH por el sistema MPO/H2O2/nitrito. La mezcla de inactivación contenía PO4H2K-PO4HK2 50 mM, pH 6.0, LADH 0.5 µM y MPO (0.5 U/ml), H2O2 (0.25 mM) y NO2Na (mM) como se indica en la Figura. Otras condiciones experimentales según Material y métodos.

Fig. 4.- Protección (P %)) de la LADH por el glutatión reducido (GSH), la N-acetilcisteína (NAC) y el Captopril (CPT), contra el sistema MPO/H2O2/ClNa. Condiciones experimentales como en la Figura 1, excepto el tiol agregado, cuya concentración se indica en la abscisa. Tiempo de incubación como se indica en la Figura. Otras condiciones experimentales según Material y métodos. C, muestra control incubado sin tiol.
Fig. 5.- Inactivación de la LADH por el sistema MPO/H2O2/ClNa en presencia de GSSG y TS2. Protección por el glutatión oxidado GSSG y la tripanotiona TS2. La mezcla de reacción contenía sistema, GSSG (0.2 mM) y TS2; (0.2 mM) como se indica en la Figura C, testigo sin disulfuro. Otras condiciones experimentales según la leyenda de la Figura 4.