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PARTICIPACION DE EPITOPES FLAGELARES DE CAMPYLOBACTER JEJUNI EN
LA ADHESION CELULAR
EDILIA ANDREWS1, HERIBERTO FERNANDEZ2, HUGO FOLCH3, GISELA ELLER3,
MIREILLE POLLETTE4
1 Departamento de Microbiología, Universidad de Concepción; 2
Instituto de Microbiología Clínica e 3 Instituto de Inmunología,
Facultad de Medicina, 4 Instituto de Microbiología, Facultad de
Ciencias, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile
Palabras clave: Campylobacter jejuni, adhesion, flagelo,
anticuerpos monoclonales
Resumen
Utilizando
una cepa flagelada (052) y una aflagelada (T-1), se estudió la participación de epítopes flagelares de C. jejuni en la adhesión a
células HEp-2 in vitro.
La cepa 052 presentó una capacidad de adhesión significativamente
mayor que la cepa T-1.
Cuando los ensayos de adhesión fueron realizados en presencia de
anticuerpos
monoclonales dirigidos contra epítopes flagelares, la capacidad de
adhesión de la cepa 052 experimentó una inhibición que fluctuó
entre 64,3 y 92,9%. Mediante una prueba de ELISA se comprobó que
estos anticuerpos monoclonales eran específicos y estaban dirigidos
exclusivamente contra epítopes flagelares de la cepa 052, no
reaccionando con la cepa T-1.
Estos resultados demuestran que epítopes flagelares de C. jejuni
estarían participando en el proceso de adhesión, sugiriendo la
intervención del flagelo en la instalación del proceso infeccioso.
Abstract
Participation
of Campylobacter jejuni flagellar epitopes in cellular adhesion. Using
a flagellated (052) and an aflagellated (T-1) strains we studied the
participation of flagellar epitopes of C. jejuni in the adhesion to
HEp-2 cells in vitro. Strain 052 was
significantly more adherent than strain T-1. When adhesion assays were
carried out with
antiflagella mono-clonal antibodies, strain 052 showed inhibition of
their adhesive capacity that varied between 64.3 and 92.9%. With an
ELISA test it was demonstrated that those monoclonal antibodies were
specific and directed exclusively against flagellar epitopes of strain
052 being unreactive with strain T-1. Our results show that flagellar
epitopes could participate in the adhesion process suggesting that
flagella could be involved in the installation of the infectious
process.
Recibido: 9-V-1995 Aceptado: 22-IV-1996
Dirección postal: Dr. Heriberto Fernández. Instituto de
Microbiología Clínica, Universidad Austral de Chile, Casilla 567,
Valdivia, Chile
Campylobacter jejuni es un bacilo Gram negativo curvo, de carácter
zoonótico, reconocido co-mo importante agente productor de diarrea en
el hombre, tanto en países industrializados como en aquellos en vías
de desarrollo1, 2. Esta bacteria ha sido aislada como patógeno
entérico en prácticamente todos los países latinoamericanos, con
frecuencias variables (México 5,3%, Argentina 6,1%, Venezuela 9,2%,
Chile 5,7-14,1%, Brasil 7,3-18,5%, Panamá 11,7%, Perú 15-23% y
Ecuador 23%), posiblemente debido a las condiciones ecológicas
propias de cada lugar, que intervienen en el ciclo epidemiológico de
C. jejuni 2.
Es importante conocer los factores de virulencia de las diferentes
bacterias patógenas, tanto para entender los procesos involucrados en
la interacción huésped-parásito como para conocer de su existencia
en cepas aisladas de diversos orígenes, en especial en bacterias como
C. jejuni cuya distribución en la naturaleza es bastante amplia2. Los
mecanismos de patogenicidad identificados en C. jejuni son la
capacidad para producir toxinas y para invadir el epitelio intestinal.
La adhesión a superficies mucosas ha sido descrita recientemente como
otro de sus factores de virulencia, la cual estaría mediada por el
lipopo-lisacárido, algunas proteínas de membrana externa y el
flagelo3, 4.
La adhesión en Campylobacter ha sido observada utilizando cultivos
celulares5, 6, 7. Sin
embargo, las estructuras responsables de este proceso no han sido bien
definidas. Varios
trabajos realizados en animales de experimentación han aportado
evidencias de la
participación del flagelo en la colonización intestinal, sugiriendo
su rol como eventual
adhesina e indicando que el proceso de adhesión de C. jejuni a
células de mamíferos,
supuestamente como etapa previa a la colonización estaría mediado,
en gran proporción, por esta estructura bacteriana4, 6, 8, 9. Este
hecho reviste importancia para explicar la patogenia del cuadro
diarrei-co y, en forma más específica, para explicar los pasos que
anteceden a la instalación definitiva del proceso diarreico.
El objetivo de este trabajo fue determinar, en el flagelo de C.
jejuni, la presencia de epítopes flagelares que pudiesen participar
en la adhesión de esta bacteria a células HEp-2.
Material y Métodos
Cepas bacterianas: En este estudio fue utilizada una cepa virulenta
de C. jejuni (cepa 052), aislada de las deposiciones de un lactante de
sexo masculino, de 4 meses de edad,
ingresado al Servicio de Pediatría del Hospital Regional de Valdivia,
por presentar síndrome diarreico agudo y que no había recibido
tratamiento antimicrobiano.
Como control negativo fue utilizada la cepa de C. jejuni T-1, una
variante aflagelada, cedida por el Dr. M. García del «Laboratory
Center for Disease Control», Ontario, Canadá.
Microscopía electrónica (ME) y anticuerpos monoclonales (AM): La
presencia o ausencia de flagelos en las cepas estudiadas se
estableció por ME, mezclando 250 µl de bacterias con una solución
acuosa de ácido fosfotúngstico al 2%, pH 6. Las preparaciones,
teñidas negativamente, fueron aplicadas a una grilla cubierta con
membrana de colodión y film de carbón, siendo observadas en
microscopio Philips EM-300 con un voltaje de aceleración de 60 KW10.
Utilizando el mismo método se comprobó la pureza de las
preparaciones de flagelos puros, aislados de las células bacterianas
por el método de centrifugación diferencial propuesto por Ueki y
col11, con los cuales se prepararon AM.
Los AM utilizados (1F12, 2A5, 2A12 y 3A3) fueron obtenidos en el
Instituto de Inmunología de la Universidad Austral de Chile por los
métodos habituales12 y su reactividad frente al flagelo de C. jejuni
fue medida por ELISA6 utilizando como antisuero 100 µl de
sobrenadante sin diluir del cultivo de los clones. El mismo ensayo se
repitió con 100 µl de sonicado de C. jejuni T-1. Como control de
lectura inespecífica se utilizó suero de ratón no inmunizado
diluido 1/500 y como control negativo, medio RPMI-1640. Fueron
considerados positivos los sobrenadantes que mostraban lecturas tres
veces más altas que la del suero de ratón no inmunizado.
Ensayos de adhesión a células HEp-2: Fueron realizados en monocapas
de células HEp-2 cultivadas en placas Lab-Tek de 8 pocillos, con
medio RPMI-1640 adicionado de 10% de suero fetal bovino
(RPMI-10%)5,14. Las monocapas fueron lavadas dos veces con 1 ml de
RPMI-10%, inoculadas con una suspensión (108 u.f.c.) de la cepa 052 o
de la cepa T-1 en el mismo medio e incubadas por 18 h a 37°C en
estufa de CO2. Posteriormente, fueron lavadas 5 veces con PBS, fijadas
con metanol, teñidas con Giemsa y examinadas por microscopía de
contraste de fase (1000X). La adhesión bacteriana fue determinada
siguiendo el criterio de Lindblom y col15 considerándose que hubo
adhesión cuando al menos el 20% de las células HEp-2 presentaban una
o más bacterias adheridas.
Ensayos de inhibición de la adhesión: La cepa 052 fue suspendida
(108 u.f.c.) en 1 ml del sobrenadante de los hibridomas productores de
AM. Cada suspensión fue incubada durante 30 min a 37°C en atmósfera
de microaerofilia, cen-trifugada y los sedimentos bacterianos
resuspen-didos en RPMI-10%, inoculados en monocapas de células HEp-2,
continuando con el procedimiento descrito para los ensayos de
adhesión. Se consideró que hubo inhibición significativa de la
adhesión cuando ésta experimentó una reducción igual o superior a
50% en relación a los ensayos realizados en ausencia de
anticuerpos16. Como control negativo se utilizó 1 ml de RPMI-10% sin
anticuerpos.
Todos los ensayos fueron realizados dos veces, en duplicado. Los
resultados se expresaron como la media obtenida en los cuatro ensayos,
para cada una de las condiciones experimentales.
Análisis estadístico: El análisis estadístico de los resultados
fue realizado utilizando la dócima de proporciones «z»17.
Resultados
La ME permitió confirmar la presencia de un flagelo de 6,8 µm de
longitud en cada extremode la cepa C. jejuni 052 (Fig. 1a). La imagen
obtenida por ME de la cepa T-1 aflagelada se muestra en la Fig.
1b. Ninguna de las dos cepas en estudio presentó fimbrias u otras
estructuras similares. La centrifugación diferencial resultó
apropiada para obtener fracciones del flagelo de longitud variable
(0,1-3,0 µm), sin que se observen otras estructuras o partes del
cuerpo bacteriano (Fig. 1c).
La interacción de C. jejuni con la línea celular HEp-2 se muestra en
la Tabla 1. La cepa 052 tiene la capacidad de adherirse a células
epiteliales en cultivo (Fig. 2a). El 70% de las células HEp-2
presentaron adhesión bacteriana con un promedio de 4,46 (± 2,29)
bacterias por célula. La cepa T-1 también demostró capacidad de
adherencia (Fig. 2b), aunque en una proporción significati-vamente
menor (27,5%) y con un promedio de 1,36 (± 0,78) bacterias adheridas
por célula.
Establecido el fenómeno de adhesión, se evaluó la actividad de 4 AM
antiflagelo (1F12, 2A5, 2A12, 3A3) en relación a la capacidad de
adhesión observada con la cepa 052. Como se detalla en la Tabla 2,
todos los AM utilizados fueron capaces de inhibir la adhesión de esta
cepa a las células HEp-2. El porcentaje de inhibición más alto
(92,9%) lo presentó el anticuerpo producido por el clon 2A5. El AM
1F12, previamente identificado por ELISA como bajo productor de
anticuerpos, inhibió en menor porcentaje el fenómeno de adhesión
(64,3%) observándose, en estos ensayos, el mayor número de bacterias
adheridas por célula.
La especificidad de los AM antiflagelo se demostró con un ensayo de
ELISA en el cual los sobrenadantes de los clones productores de
anticuerpos fueron probados, paralelamente, con sonicado de bacterias
enteras de la cepa C. jejuni 052 y de la cepa aflagelada T-1. Como se
aprecia en la Fig. 3, los 4 sobrenadantes presentaron anticuerpos
contra la cepa 052, sin expresar reactividad inmunológica con la cepa
T-1. Estos resultados demuestran que los 4 AM utilizados estaban
dirigidos exclusivamente contra epítopes flagelares.
Discusión
Las bacterias enteropatógenas deben vencer diversos mecanismos de
defensa del huésped para establecer exitosamente el proceso de
infección intestinal. La capa de mucus que recubre el epitelio y los
movimientos peristálticos eliminan rápidamente los organismos no
adheridos a la mucosa18. Sin embargo, las bacterias móviles pueden
atravesar la capa de mucus y sobrevivir junto a las células
epiteliales o en las criptas. El contacto con el epitelio intestinal
puede aumentar, además, a través de la unión mediada por moléculas
existentes en la superficie de la bacteria y de la célula
epitelial19. C. jejuni es una bacteria que no presenta fimbrias y en
cuya superficie tampoco se observa otras estructuras fibrosas,
postulándose que las proteínas que potencialmente podrían
participar en los procesos de adhesión de la bacteria a las células
epiteliales del huésped estarían ubicadas en los flagelos4.
En nuestro estudio hemos podido confirmar, por ME la presencia de un
flagelo de 6,8 µm de longitud en cada extremo de la cepa 052 (Fig.
1a) y la ausencia de éstos en la cepa T-1 (Fig. 1b). Ninguna de las
dos cepas en estudio presentó fimbrias u otras estructuras similares,
lo que concuerda con las observaciones realizadas por Pead10 y por
Hernández y col20.
La importancia de la motilidad de Campylo-bacter como factor de
colonización intestinal fue preconizada por Morooka y col9 y Diker y
col8 en un modelo de ratón recién nacido. Newell y McBride6,
utilizando el mismo modelo experimental, informaron que la
colonización fue igualmente eficiente en una cepa silvestre móvil
como en una mutante flagelada inmóvil, mientras que con una cepa
aflagelada la colonización fue pobre, sugiriendo que el flagelo,
activo o inactivo, es necesario para la colonización del tracto
gastro-intestinal de ratón por C. jejuni. Con estas evidencias, nos
abo-camos al estudio de la interacción de C. jejuni con la línea
celular HEp-2 pudiendo comprobar que la cepa 052 tiene la capacidad de
adherirse a células epiteliales en cultivo (Fig. 2a). El 70% de las
células HEp-2 presentó adhesión bacteriana con un promedio de 4,46
(± 2,29) bacterias por célula (Tabla I). La cepa aflagelada T-1
también mostró capacidad de adherencia (Fig. 2b). Sin embargo, la
proporción de células con bacterias asociadas (27,5%) y el promedio
de bacterias adheridas por célula (1,36 ± 0,78) fueron
significativamente menores (Tabla 1).
El fenómeno de adhesión, que fue observado reiteradamente con la
cepa C. jejuni 052 en una cuantía aproximadamente 3 veces mayor a la
encontrada con la cepa aflagelada T-1, sugiere la participación del
flagelo en la asociación de la bacteria con la célula epitelial.
Estos resultados, obtenidos in vitro, estarían en concordancia con
las observaciones hechas en modelos animales por Morooka y col9,
Newell y McBride6 y Diker y col8 quienes establecen que el flagelo es
un factor necesario para promover la colonización intestinal de C.
jejuni en ratones. Pavloskis y col21, utilizando conejos como modelo
biológico, también concluyen que los flagelos de Campylobacter son
necesarios para inducir la colonización intestinal los cuales,
además, son capaces de provocar una respuesta inmune protectora.
Establecido el fenómeno de adhesión, se evaluó el efecto de 4 AM
antiflagelo (1F12; 2A5, 2A12, 3A3) sobre la capacidad de adhesión de
la cepa 052 (Tabla 2). Cuando se realizaron ensayos de adhesión en
presencia de AM, se observó inhibición del fenómeno de adhesión.
El anticuerpo producido por el clon 2A5 produjo el efecto inhibitorio
más alto (92,9%), lo cual podría indicar que el epítope al cual se
dirige este anticuerpo estaría más expuesto en el flagelo, se
presentaría en forma más repetida sobre la molécula o su rol sería
más importante en el proceso de adhesión. Alternativamente, podría
pensarse que estos resultados se deben solamente a que este anticuerpo
tiene mayor afinidad por el epítope que los AM 3A3 y 2A12, los que
ejercieron una acción inhibitoria similar (75% y 78,6 %
respectivamente) y menor que la ejercida por el monoclonal 2A5. El AM
1F12, previamente identificado por ELISA como bajo productor de
anticuerpos, ejerció el menor efecto inhibitorio sobre el fenómeno
de adhesión (64,3%) presentando, además, el mayor número de
bacterias adheridas por células. Las diferencias observadas en
relación a la inhibición de la adhesión permiten sospechar que
existen epítopes que participarían más eficiente-mente que otros en
la adhesión, ya sea por su configuración o por su ubicación en el
filamento flagelar. En un trabajo previo, Newell22 describió la
existencia de, al menos, 6 epítopes diferentes en el flagelo de
Campylobacter.
La especificidad de los AM antiflagelo se demostró con un ensayo de
ELISA en el cual los sobrenadantes de los clones productores de
anticuerpos fueron probados, paralelamente, con sonicado de bacterias
enteras de las cepas 052 y T-1. Como se observa en la Fig. 3, ninguno
de los 4 sobrenadantes que mostraron positividad frente a la cepa 052
reaccionó con la cepa T-1. El hecho que los AM hayan reaccionado
sólo con un sonicado de la cepa flagelada demuestra que ellos estaban
dirigidos exclusivamente contra epítopes flagelares, los cuales no se
encuentran en el sonicado de la cepa T-1, formado únicamente por
antígenos somáticos. Por otro lado, estos resultados indican que la
centrifugación diferencial11 resultó apropiada para obtener
fracciones puras de flagelos, libres de otras estructuras o partes del
cuerpo bacteriano (Fig. 1c). Los AM utilizados en este trabajo, todos
de la clase IgG, presentaron diferente reactividad inmunológica con
la prueba de ELISA, lo cual, junto a los diferentes efectos observados
sobre la adhesión, sugieren que los epítopes flagelares parecen ser
distintos, participando con diferentes grados de eficiencia en el
fenómeno de adhesión y en la inducción de anticuerpos. La
inhibición de la adhesión por estos AM podría ser la expresión in
vitro del efecto protector observado in vivo por Pavloskis y col21
utilizando
anticuerpos policlo-nales antiflagelos y por Ueki y col23 utilizando
AM de la clase IgM e IgA.
Newell22, utilizando 6 AM de la clase IgG y 2 de la clase IgM, no
encontró el efecto protector descrito por Pavloskis y col21 y Ueki y
col23. Sin embargo, establece que existirían varios epítopes
flagelares, los que por una inadecuada exposición en el flagelo no
ejerce- rían el efecto protector observado por estos autores.
Nuestos resultados demuestran que el flagelo de Campylobacter
participa en la adhesión y, por tanto, esta estructura tendría
participación en la instalación del proceso infeccioso. La proteína
flagelar de C. jejuni ha sido reconocida como altamente inmunogénica
en seres humanos24 y como la inmunidad protectora a bacterias
enteropa-togénicas se asocia con una rápida eliminación del
microorganismo en el intestino, estos anticuerpos estarían dirigidos
contra antígenos de colonización. Creemos que estudios futuros que
permitan una mejor comprensión de las interacciones entre la adhesina
y el receptor conducirán a nuevos modos de intervenir en el proceso
infeccioso. En relación a Campylobacter, ésto es especialmente
importante en países en vías de desarrollo donde el porcentaje de
aislamiento de estas bacterias en casos de diarrea es alto, como
ocurre en Asia, Africa y América Latina1, 2.
Agradecimientos: Este trabajo contó con el apoyo financiero
de los proyectos S-92-05
DID.UACH, FONDECYT 59-89 y FONDECYT 1930353.
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TABLA 1.- Adhesión de las cepas de Campylobacter jejuni 052
(virulenta) y T-1 (variante0 aflagelada) a células HEp-2.
CEPAS Adhesión (%) _x Bact/cel ± SD
052 70,0* 4,46 ± 2,29*
T-1 27,5* 1,36 ± 0,78*
_x Bact/cel ± SD: Promedio de bacterias adherida por célula ±
desviación estándar
* p < 0,01
TABLA 2.- Subclase de los hibridomas productores de anticuerpos
monoclonales y su efecto sobre la adhesión de la cepa 052 a células
HEp-2
CLONES Subclase % de inhibición _x Bact/cel
Ig G de la adhesión ± SD
1F12 Ig G2a 64,3 3,80 ± 0,76
2A5 Ig G3 92,9 1,50 ± 0,55
2A12 Ig G3 78,6 2,70 ± 1,67
3A3 Ig G3 75,0 1,86 ± 0,66
_x Bact/cel ± SD: Promedio de bacterias adheridas por célula ±
desviación estándar.
Fig. 1.- Fotomicrografía electrónica de C. jejuni mostrando (a)
una célula flagelada de la
cepa 052 (16.000x); (b) una célula aflagelada de la cepa T-1 (16.000
x) y (c) una preparación
de flagelos purificados de la cepa 052 (22.572 x). Barra = 1 µm.
Fig. 2.- Fotomicrografía mostrando (a) adhesión de las cepas 052 y
(b) de la cepa T-1 de C.
jejuni a células HEp-2 (1.000 x). Barra = 8 µm
Fig. 3.- Resultados del ELISA de 4 clones anti-flagelo de
Campylobacter probados contra
bacterias enteras de las cepas 052 y T-1.
(Abs. 402 nm = absorbancia a 402 nanómetros).
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